一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法。

背景技术：

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，在临床上用于治疗各种胆石类疾病，对各种急、慢性肝病，具有良好的效果，市场需求巨大。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，成本过高，而且有违于人道原则，因而人工合成UDCA具有重要意义。2004年7月26日，美国FDA1批准Axcan制药公司熊去氧胆酸片剂(500mg)，治疗原发性胆汁淤积性肝硬化(PBC),是目前惟一被美国FDA批准治疗原发性胆汁淤积性肝硬化的药物。临床试验证实，UDCA具有良好的安全性，不良反应发生率低，可以大规模应用于医疗，但国内苦于合成技术受制于人，故而该技术的突破具有打断美国垄断市场，降低国内患者治疗代价的重要意义。

在专利号为CN105368828B中公开了一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法；但是方法提取熊去氧胆酸比较繁琐，并且熊去氧胆酸的转化率低，并且在对菌液进行离心处理的过程中，不便于取放不同直径的试管，导致操作麻烦，同时不能一次可对大量的菌液进行离心，工作效率低；因此设计一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法。

技术实现要素：

为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、在7α-羟基类固醇脱氢酶和氧化型辅酶NAD⁺或NADP⁺存在的条件下将溶于水溶液中的底物结合态鹅去氧胆酸的7位α-羟基氧化成羰基，形成中间产物结合态7-羰基-石胆酸；

步骤二、在步骤一反应后的混合物中，向混合物中加入7β-羟基类固醇脱氢酶和还原型辅酶NADH或NADPH，将中间产物7位羰基还原成β-羟基得到结合态熊去氧胆酸；

所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶是在大肠杆菌BL21中的表达产物；将转化成功的大肠杆菌重组菌株按5％的添加量加入LB液体培养基中，220rpm、37℃培养；待OD600为0.5时，16℃、IPTG诱导12小时，使大肠杆菌产生GST融合蛋白；驱动离心设备中电动伸缩杆，将顶盖顶起，然后将诱导完成的大肠杆菌倒入到第二试管和第一试管中，合上顶盖，驱动旋转电机，通过转轴带动转盘转动，转盘带动第二试管和第一试管转动，离心3min，再次打开顶盖，拿起第二试管和第一试管，收集菌体，300W超声破壁菌液5min至澄清；4℃在离心设备中离心15min收集上清液；上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B、4℃结合2h，使GST融合蛋白结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶中，再利用预冷的五倍体积0.25％吐温20PBS溶液冲洗三次，利用预冷的五倍体积PBS冲洗三次；4℃酶切12h，在离心设备中离心得到目的蛋白。

作为本发明进一步的方案：所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶转化的底物是以天然混合物状态存在；所述天然混合物状态为禽畜胆汁；禽畜胆汁为鸡、鸭、鹅的胆汁。

作为本发明进一步的方案：所述禽畜胆汁的制备：用75％酒精分别对鸡胆、鸭胆、鹅胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。

作为本发明进一步的方案：所述水溶液为pH8.5磷酸盐缓冲液；所述结合态鹅去氧胆酸为牛磺鹅去氧胆酸；结合态熊去氧胆酸为牛磺熊去氧胆酸。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一、二的反应温度为30℃，反应时间为1-3小时。

作为本发明进一步的方案：所述离心设备的工作步骤为：首先驱动电动伸缩杆，顶起顶盖，将滑动板插到固定板上固定，同时将第二试管插入滑动板一侧插孔中固定，并将L型插板插入第二插接槽中，同时将第一试管插入L型插板的插孔中固定，然后向第一试管和第二试管中倒入菌液，合上顶盖，驱动旋转电机，通过转轴带动转盘转动，从而带动第二试管和第一试管转动，进行离心，离心后，可再次打开顶盖，将第二试管和第一试管取下，倒出菌液。

作为本发明进一步的方案：所述离心设备包括箱体和顶盖，所述箱体的内部开设有凹槽，所述凹槽的内部设置有离心组件，所述离心组件包括固定板、第一插接槽、转盘、弹簧、支撑柱、旋转电机、三角板、L型插板、第一试管、第二插接槽、滑动板、第二试管、转轴和限位杆，所述凹槽的内部呈三角形设置有三根支撑柱，三根支撑柱的顶部均通过弹簧与三角板连接，所述三角板的顶部周围固定安装有旋转筒体，所述三角板底部中心处固定安装有旋转电机，所述旋转电机的输出轴与转轴连接，所述转轴穿过三角板与转盘固定连接，所述转盘的外围呈圆周形等距离开设有若干个第二插接槽，所述第二插接槽用于插入L型插板，所述L型插板上插接固定有第一试管，所述转盘的内围呈圆周形等距离开设有若干个第一插接槽，所述第一插接槽中固定安装有固定板，滑动板插接在固定板上，所述滑动板的两侧固定安装有限位杆，所述限位杆插入第一插接槽用于限位，所述滑动板的一侧可插接固定第二试管；所述第二试管的直径比第一试管直径小；

所述箱体的顶部一端铰链连接有顶盖，所述顶盖为玻璃盖，所述顶盖中心处开设有通孔，所述箱体的内部铰接有电动伸缩杆，所述电动伸缩杆的另一端与顶盖铰链连接。

本发明的有益效果：

1、本发明在水溶液状态下，特别是在PBS溶液中，能在7α-HSDH和7β-HSDH存在下转化底物结合态鹅去氧胆酸为结合态熊去氧胆酸，而且中间步骤不需要分离，非常简单，而且反应底物浓度高达100g/L，转化率大于99.5％，熊去氧胆酸收率95％以上，产品质量符合国际标准，工艺先进，环境友好；特别是作为混合物状态的鸡胆汁，鸭胆汁或鹅胆汁，不需要将结合态鹅去氧胆酸进行分离纯化就能发生反应，该制备工艺简单，易行，为结合态熊去氧胆酸原料提供了新的简便的制备方法；

2、菌液在进行离心的过程中，首先将滑动板插到固定板上固定，同时将第二试管插入滑动板一侧插孔中固定，并将L型插板插入第二插接槽中，同时将第一试管插入L型插板的插孔中固定，一方面便于取放L型插板和滑动板，另一面便于取放第二试管和第一试管，操作简单，使用方便，然后向第一试管和第二试管中倒入菌液，由于第一插接槽和第二插接槽均呈圆周形等距离开设，这样的设置，便于节省空间，一次可对大量的菌液进行离心，提高工作效率，由于第二试管的直径比第一试管直径小，便于对不同直径的试管进行离心处理，合上顶盖，驱动旋转电机，通过转轴带动转盘转动，从而带动第二试管和第一试管转动，进行离心，离心后，可再次打开顶盖，将第二试管和第一试管取下，倒出菌液；

支撑柱的顶部均通过弹簧与三角板连接，弹簧的设置，可降低旋转电机所产生的振动，增加设备的稳定性。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明离心设备整体结构示意图；

图2是本发明离心设备俯视结构示意图；

图3是本发明离心设备侧视结构示意图；

图4是本发明离心设备爆炸结构示意图；

图5是本发明中离心组件整体结构示意图；

图6是本发明中离心组件正视整体结构示意图；

图7是本发明中离心组件俯视结构示意图。

图中：1、箱体；2、凹槽；3、顶盖；4、通孔；5、电动伸缩杆；6、旋转筒体；7、离心组件；71、固定板；72、第一插接槽；73、转盘；74、弹簧；75、支撑柱；76、旋转电机；77、三角板；78、L型插板；79、第一试管；710、第二插接槽；711、滑动板；712、第二试管；713、转轴；714、限位杆。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-7所示，一种高效全细胞催化制备熊去氧胆酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、在7α-羟基类固醇脱氢酶和氧化型辅酶NAD⁺或NADP⁺存在的条件下将溶于水溶液中的底物结合态鹅去氧胆酸的7位α-羟基氧化成羰基，形成中间产物结合态7-羰基-石胆酸；

步骤二、在步骤一反应后的混合物中，向混合物中加入7β-羟基类固醇脱氢酶和还原型辅酶NADH或NADPH，将中间产物7位羰基还原成β-羟基得到结合态熊去氧胆酸；

所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶是在大肠杆菌BL21中的表达产物；将转化成功的大肠杆菌重组菌株按5％的添加量加入LB液体培养基中，220rpm、37℃培养；待OD600为0.5时，16℃、IPTG诱导12小时，使大肠杆菌产生GST融合蛋白；驱动离心设备中电动伸缩杆，将顶盖顶起，然后将诱导完成的大肠杆菌倒入到第二试管和第一试管中，合上顶盖，驱动旋转电机，通过转轴带动转盘转动，转盘带动第二试管和第一试管转动，离心3min，再次打开顶盖，拿起第二试管和第一试管，收集菌体，300W超声破壁菌液5min至澄清；4℃在离心设备中离心15min收集上清液；上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B、4℃结合2h，使GST融合蛋白结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶中，再利用预冷的五倍体积0.25％吐温20PBS溶液冲洗三次，利用预冷的五倍体积PBS冲洗三次；4℃酶切12h，在离心设备中离心得到目的蛋白。

所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶转化的底物是以天然混合物状态存在；所述天然混合物状态为禽畜胆汁；禽畜胆汁为鸡、鸭、鹅的胆汁。

所述禽畜胆汁的制备：用75％酒精分别对鸡胆、鸭胆、鹅胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。

所述水溶液为pH8.5磷酸盐缓冲液；所述结合态鹅去氧胆酸为牛磺鹅去氧胆酸；结合态熊去氧胆酸为牛磺熊去氧胆酸。

所述步骤一、二的反应温度为30℃，反应时间为1-3小时。

所述离心设备的工作步骤为：首先驱动电动伸缩杆，顶起顶盖，将滑动板插到固定板上固定，同时将第二试管插入滑动板一侧插孔中固定，并将L型插板插入第二插接槽中，同时将第一试管插入L型插板的插孔中固定，然后向第一试管和第二试管中倒入菌液，合上顶盖，驱动旋转电机，通过转轴带动转盘转动，从而带动第二试管和第一试管转动，进行离心，离心后，可再次打开顶盖，将第二试管和第一试管取下，倒出菌液。

请参阅图1-7所示，所述离心设备包括箱体1和顶盖3，所述箱体1的内部开设有凹槽2，所述凹槽2的内部设置有离心组件7，所述离心组件7包括固定板71、第一插接槽72、转盘73、弹簧74、支撑柱75、旋转电机76、三角板77、L型插板78、第一试管79、第二插接槽710、滑动板711、第二试管712、转轴713和限位杆714，所述凹槽2的内部呈三角形设置有三根支撑柱75，三根支撑柱75的顶部均通过弹簧74与三角板77连接，所述三角板77的顶部周围固定安装有旋转筒体6，所述三角板77底部中心处固定安装有旋转电机76，所述旋转电机76的输出轴与转轴713连接，所述转轴713穿过三角板77与转盘73固定连接，所述转盘73的外围呈圆周形等距离开设有若干个第二插接槽710，所述第二插接槽710用于插入L型插板78，所述L型插板78上插接固定有第一试管79，所述转盘73的内围呈圆周形等距离开设有若干个第一插接槽72，所述第一插接槽72中固定安装有固定板71，滑动板711插接在固定板71上，所述滑动板711的两侧固定安装有限位杆714，所述限位杆714插入第一插接槽72用于限位，所述滑动板711的一侧可插接固定第二试管712；所述第二试管712的直径比第一试管79直径小；

所述箱体1的顶部一端铰链连接有顶盖3，所述顶盖3为玻璃盖，所述顶盖3中心处开设有通孔4，所述箱体1的内部铰接有电动伸缩杆5，所述电动伸缩杆5的另一端与顶盖3铰链连接。

本发明的工作原理：首先驱动电动伸缩杆5，顶起顶盖3，将滑动板711插到固定板71上固定，同时将第二试管712插入滑动板711一侧插孔中固定，并将L型插板78插入第二插接槽710中，同时将第一试管79插入L型插板78的插孔中固定，一方面便于取放L型插板78和滑动板711，另一面便于取放第二试管712和第一试管79，操作简单，使用方便，然后向第一试管79和第二试管712中倒入菌液，由于第一插接槽72和第二插接槽710均呈圆周形等距离开设，这样的设置，便于节省空间，一次可对大量的菌液进行离心，提高工作效率，由于第二试管712的直径比第一试管79直径小，便于对不同直径的试管进行离心处理，合上顶盖3，驱动旋转电机76，通过转轴713带动转盘73转动，从而带动第二试管712和第一试管79转动，进行离心，离心后，可再次打开顶盖3，将第二试管712和第一试管79取下，倒出菌液；

支撑柱75的顶部均通过弹簧74与三角板77连接，弹簧74的设置，可降低旋转电机76所产生的振动，增加设备的稳定性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。