一种创建油菜细胞核雄性不育系和保持系的方法与流程

本发明涉及一种创建油菜细胞核雄性不育系和保持系的方法，涉及基因工程领域。
背景技术：
：十字花科是典型的异花授粉作物，杂种优势非常明显，利用雄性不育系进行杂交育种可以得到纯度高、性状好的杂交种，且制种过程简单，成本低。作物雄性不育根据不育基因的遗传方式和在细胞中的定位分为细胞核雄性不育(gms)和细胞质雄性不育(cms)。目前生产上利用最多的雄性不育系为细胞质雄性不育系，它被广泛应用到油菜、菜花、甘蓝、大白菜、小白菜等十字花科作物中，该类型雄性不育虽然应用面广，但是不育源较少，在十字花科作物中已报道的细胞质雄性不育有pol,ogura,nap，shan2a,nigra,tour,nea，hau,nsa和nca等，在我国生产使用的主要是pol、ogura和shan2a系统。单一化的雄性不育种质导致了杂交种综合性状难以得到突破性的提高，对外界有害生物与环境的抵抗力较低，存在潜在的生产风险。如1970年美国大面积种植t型细胞质的玉米杂交种，因玉米小斑病t小种的爆发流行，导致玉米产业遭受严重的经济损失。同时细胞质雄性不育易受环境条件影响，其育性不够稳定，不育系败育不彻底；在十字花科作物中细胞质雄性不育系统存在几个固有问题，同源不育基因保持系资源较少，异源不育基因恢复系的种质资源狭窄，这些问题困扰着细胞质雄性不育在十字花科作物杂交育种中的应用。相对于细胞质雄性不育，细胞核雄性不育是由细胞核基因控制的，不受细胞质影响，没有正、反交遗传效应。核雄性不育系具有育性稳定、恢复源广的优点。核雄性不育可以有效地解决细胞质雄性不育存在的缺陷。但是，核雄性不育的保持系只有50％的保持率，在生产上很难直接利用。虽然在甘蓝型油菜中发现了新的细胞核雄性不育材料9012a，它受三对核基因控制，分别为两对隐性重叠不育基因和一对隐性上位可育基因，并选育出具有100％保持能力的保持系。在大白菜中利用核隐性基因和显性上位基因育出了能够100％保持的核雄性不育保持系。通过类似的方法，科研工作者先后育成了个别品种应用于生产，但在生产中所占比例很低。由于这些不育材料涉及的基因较多，在育种利用上十分复杂，虽已发现多年，没有得到广泛采用。随着生物技术的发展，核雄性不育材料的应用得到了根本改善。美国先锋公司发明了一项杂交种子生产技术(spt)，这种新的基因工程手段能够充分利用隐性核不育突变材料，将花粉育性恢复基因、花粉致死基因和标记筛选基因紧密连锁并导入核雄性不育突变体中，从而获得相应的保持系，有效解决了隐性核雄性不育系的繁殖难题，同时该方法还解决了产品的转基因问题，为隐性核不育材料的利用提供了新的模式。北京大学的邓兴旺团队利用玉米隐性核雄性不育的解决方案，在水稻中解决了隐性核雄性不育基因osnp1的利用问题。在十字花科作物中，目前已在大白菜、甘蓝、油菜、小白菜等作物的自然群体中发现了显性或隐性核雄性不育材料。如南京农业大学上世纪80年代在小白菜中发现细胞核雄性不育材料，并利用“两用系”进行杂交制种；福建省农科院在当地菜心品种“七叶心”中发现核雄性不育材料，并获得了雄性不育两用系；沈阳农业大学在小青口、二青帮大白菜品种中获得了隐性核基因雄性不育材料；沈阳市农科所在“万泉青帮”地方大白菜品种中发现了显性核基因雄性不育材料，并提出了“显性核基因雄性不育与显性上位基因互作”雄性不育遗传模式，最终获得了具有100％不育率的大白菜雄性不育系；中国农科院在甘蓝的自然群体中发现了显性核基因控制的雄性不育材料。在萝卜的研究上，在自然群体中发现由核基因控制的雄性不育材料，并分离克隆到了萝卜雄性不育基因。然而，在十字花科作物中，国内真正定位到的细胞核雄性不育基因还很少。技术实现要素：本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种创建油菜细胞核雄性不育系和保持系的方法，直接通过crispr-cas9技术，敲除油菜野生型中的loc106443696基因和loc106370785基因创建不育系，并通过对不同的敲除个体进行杂交筛选获得其细胞核雄性不育系和保持系，为该基因在油菜及十字花科植物中的应用奠定基础。一种创建油菜细胞核雄性不育系和保持系的方法，通过基因编辑技术，敲除油菜野生型中的loc106443696基因和loc106370785基因，创建油菜细胞核雄性不育系，并通过测交的方法筛选出保持系。进一步的上述的方法，包括如下步骤：1)筛选一对可获得油菜核雄性不育系的敲除靶点，利用该靶点构建单靶点敲除载体，将获得的敲除载体转入农杆菌中，获得含有敲除载体的农杆菌；2)将步骤1)获得的含有敲除载体的农杆菌侵染油菜下胚轴，敲除油菜野生型中的loc106443696基因和loc106370785基因，获得转化苗，从获得的转化苗中筛选出阳性植株；3)将步骤2)获得的阳性植株进行种植，开花期表现雄性不育的植株即为完全敲除株，其余植株为部分敲除植株；4)以步骤3)中获得的完全敲除株为母本，以步骤2)中获得的部分敲除株为父本进行杂交，不同的杂交组合获得不同分离情况的杂交f1代；5)选取步骤4)获得的杂交f1代中的同一个杂交组合下的f1代的可育株与不可育株比例为1:1的杂交组合，用上述杂交组合中的可育株和不可育株再进行杂交，获得杂交f2代；6)步骤5)中获得的f2代中出现可育株与不可育株，该不可育株即为不育系，可育株即为保持系。进一步的，上述步骤1)中所述的可获得油菜核雄性不育系的敲除靶点包括靶点1和靶点2，其序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。进一步的，上述步骤1)中所述单靶点敲除载体的构建采用了华南农业大学生命科学学院刘耀光院士团队的改良载体pylcrispr/cas9p35s-h及其操作步骤。进一步的，步骤2)中所述loc106443696基因和loc106370785基因的dna序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。进一步的，步骤2)中所述loc106443696基因和loc106370785基因的蛋白质序列分别如seqidno.5(xp_013740694)和seqidno.6(xp_013666227)所示。进一步的，步骤2)中所述的阳性植株为经测序比对后筛选获得的含有敲除载体的植株。进一步的，步骤6)中所述的f2代中可育株与不可育株的比例为1:1。进一步的，上述方法也可以应用于创建其他十字花科植物细胞核雄性不育系和保持系。有益效果：(1)获得的雄性不育系不受环境条件影响，其育性稳定，不育系败育彻底；克服了在十字花科作物中细胞质雄性不育系存在的同源不育基因保持系资源较少，异源不育基因恢复系种质资源狭窄的问题。(2)本发明虽然采用了基因编辑和转基因技术，但采用本发明创建的不育系不含转基因的成分。(3)本发明与其它雄性不育基因的利用相比，最大优势就是可以直接通过敲除野生型基因创建不育系，省去了要对保持系和不育系进行多代转育的问题，大大缩短了育种时间。获得的不育系很容易获得保持系，获得的不育系任何一个正常的自交系都是它的恢复系。(4)本发明所使用的基因，在大部分十字花科作物上都存在，该项技术可以应用到含有该基因的其它十字花科作物上，应用范围广。(5)本发明的方法所创建的不育系植株除花器外其他器官发育正常。(6)本发明的方法可用于油菜及其它十字花科植物，为油菜杂交育种提供了一个新的不育源，对其它十字花科植物的杂交育种同样具有十分重要的意义。附图说明图1为靶点1与两个基因的序列示意图。图2为靶点2与两个基因的序列示意图。图3靶点1的敲除阳性植株与隐性植株的比较情况，图中黑色区域为敲除靶点。图4靶点2的敲除阳性植株与隐性植株的比较情况，图中黑色区域为敲除靶点。图5完全敲除植株的27个单菌落测序情况。图6部分敲除植株的10个单菌落测序情况。图7完全敲除植株与正常可育植株的花序比较。图8完全敲除植株与正常可育植株的花器比较。具体实施方式本发明通过以下详细的实施例给出。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，容许对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明实施例中的引物均由青岛擎科生物技术有限公司合成，序列测序由青岛擎科生物技术有限公司完成，dna抽提，rna抽提，pcr及试剂配方参照j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。实施例1：敲除靶点的设计利用e-crisp软件(http://www.e-crisp.org/e-crisp/)，分别对loc106443696基因(seqidno.3)和loc106370785(seqidno.4)基因进行靶点分析，从得分较高的靶点中寻找两个基因在该靶点上没有碱基差别的靶点，我们在这两个基因的第一个外显子上确定了靶点1(target1)，碱基序列如seqidno.1所示；在第三个外显子上确定了靶点2(target2)，碱基序列如seqidno.2所示。两个靶点在loc106443696和loc106370785基因的位置及靶点的碱基序列情况如图1、图2。以这两个靶点分别设计敲除载体。实施例2：敲除载体的构建敲除载体的构建我们采用了华南农业大学生命科学学院刘耀光院士团队的改良载体pylcrispr/cas9p35s-h及操作步骤(maetal.,2015,molecularplant,doi:10.1016/j.molp.2015.04.007)。首先根据操作要求设计必需的引物如表1所示。表1按要求设计的引物第二步，以pylgrna-atu3b为模板做2轮巢式pcr，第一轮pcr做2个反应，分别用u-f引物与4号、5号的接头反向引物，gr-r引物与4号、5号的接头正向引物；第二轮为overlappingpcr,用位置特异引物扩增出表达盒产物。反应体系如表2所示，扩增条件如表3所示。表2反应体系如下(100μl体系)pylgrna-atu3bdna5μl擎科2xt3mix酶50μl引物f(10μm)5μl引物r(10μm)5μl补充双蒸水至100μl表3扩增条件94℃5min94℃30s56℃30s72℃1min2-4步骤循环32次72℃10min10℃保存反应结束后，反应液于1％tae琼脂糖凝胶电泳。(2)克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)1)将切下带有目的片段的凝胶放入2.0ml离心管，并加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断翻转；2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；3)室温，12000rpm离心30s，弃溶液；4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃漂洗液；5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃漂洗液；6)空柱，12000rpm离心2min；7)回收柱开盖晾1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水，室温放置2min；8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。第三步，将回收的overlappingpcrdna片断构建到pylcrispr/cas9p35s-h载体上。单靶点载体与sgrna表达盒的酶切-连接反应。用变温循环进行酶切连接:先3cycles(37℃for10min,10℃for5min,20℃for5min)；再10cycles(37℃for3min,10℃for5min,20℃for5min)。最后37℃for5min。第四步，大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)(1)将5μl酶切-连接反应产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；(2)42℃温水浴热激90s，立即冰浴2-3min；(3)加入1mllb培养基，37℃培养40-50min；(4)室温下4000rpm离心3min，收集菌体；(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。第五步，取单菌落，用pb-l/pb-r引物进行pcr。扩增备件同第二步。对扩增产物回收后进行测序，选取目标菌株。实施例3：敲除载体浓杆菌的转化(电激法)1.大肠杆菌质粒dna的提取(擎科质粒小提试剂盒)(1)挑取单克隆接种于10ml含有相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养8小时；(2)室温12000rpm离心1min，收集菌体；(3)弃上清，加入100μl低温预冷的溶液ⅰ，振荡悬浮菌体；(4)加200μl溶液ⅱ，快速翻转混匀，冰浴5min；(5)溶液澄清后加入150μl的溶液ⅲ，轻轻混匀后冰浴5min；(6)4℃下12000rpm离心10min，吸取上清至回收柱中；(7)加入700ul的washbuffer，室温12000rpm离心1min，弃滤液；(8)重复上一步操作(9)室温12000rpm离心1min，换新的1.5ml收集管室温放置2min；(10)加入40μl灭菌水，放置2min后离心，将提取的质粒放至-20℃保存备用。2.农杆菌感受态的制备(无菌操作)(1)取农杆菌gv3101菌种接种于10mlyep液体培养基中，28℃摇床培养过夜；(2)按1:50接种于50mlyep液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，到od600值为0.4-0.6；(3)4℃下4200rpm离心10min，收集菌体；(4)弃上清，加10ml预冷的0.15m的nacl悬浮菌体；(5)重复步骤3；(6)弃上清，加入2ml预冷的20mm的cacl2悬浮菌体，分装于1.5ml离心管路，现用或加入终体积7％dmso经液氮速冻后-80℃保存备用。3.农杆菌的质粒转化(无菌操作)(1)将1μl质粒dna加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；(2)将冰浴后的感受态放入到电转杯中，放入电转仪上进行电转；结束后立即冰浴2-3min；(3)加入1mlyep培养基，28℃培养2-4小时；(4)室温4000rpm，离心3min，收集菌体；(5)将菌涂布于含有相应抗生素的lb培养平板上，28℃倒置培养48小时。实施例4：油菜下胚轴离体再生体系的建立及基因敲除(1)种子消毒及预培养将油菜种子用70％的乙醇消毒5min，去除乙醇后用0.1％的hgcl2消毒10min，用无菌水冲洗4-5遍。将种子播放在1/2ms培养基上，培养温度24℃，黑暗培养。(2)种子出苗5天时，取下胚轴切取至0.8-1cm长，以备浸染时用。(3)农杆菌浸染将4℃保存的带有敲除载体的农杆菌在添加了50mg/lkana的yep固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/lkana的yep液体培养基，黑暗下28℃，200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于灭菌的离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，将菌体加入到ms+30mg/l乙酰丁香酮培养液中，并调整到od600为0.4～0.6。将预切好的油菜下胚轴放入调整好的农杆菌悬浮液中，每隔5分钟晃动一次，浸染15min，取出用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放入共培养培养基上。(4)共培养共培养培养基为ms+mannitol(18g/l)+2,4-d(1.0mg/l)+kt(0.3mg/l)，在黑暗条件下，24℃共培养2天。(5)脱分化培养将共培养后的下胚轴转入到脱分化培养基[ms+mannitol(18g/l)+2,4-d(1.0mg/l)+kt(0.3mg/l)+tmt(0.3mg/l)+kana(50mg/ml)]上,在25℃下光照16小时、黑暗8小时进行培养，培养20天。(6)筛选及芽诱导将通过脱分化培养的下胚轴转移到筛选及芽诱导培养基[ms+xylose(0.25g/l)+mes(0.6g/l)+反式-zeatin(2mg/l)+iaa(0.1mg/l)+tmt(0.3mg/l)+kana(50mg/ml)]上，在25℃下，光照16小时进行培养，每两周更换一次培养基，直到分化出丛生芽。(7)生根培养筛选后长至2cm以上的丛生芽单独剪下，转移到生根培养基(ms)上，在25℃下，光照16小时进行培养，连续培养2周。(7)炼苗及移栽根系生长良好的小苗转移到育苗盘上，在25℃下，光照16小时进行培养，培养1周左右，当将小苗取出，用薄膜覆盖，以提高湿度。炼苗后就可移栽到大田了。实施例5：敲除单株的检测1.提取转化植株dna称取0.5g的t1代再生植株叶片，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xctab提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，置于65℃水浴保温2小时，不时颠倒摇动。混合物冷却至室温后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，70rpm混匀20min。4℃下10000g离心10min。将水相转移至新的离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，摇匀，-20℃放置30min沉淀dna。4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥dna后，加100μl无dna酶但含有rna酶的te液溶解，37℃水浴30min。加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀dna。4℃下10000g离心10min。弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥dna后，加40μl无菌水溶解dna，4℃保存选用。2.pcr检测阳性敲除植株根据靶点位置，分别在其上游和下游设计引物，片断大小在400至1000bp。target1检测引物序列：f：5’-gttcgatacgatgtcgaatctga-3’r：5’-tattttcctggcctttaaacca-3’target2检测引物序列：f：5’-caaaaggagagccgtggtt-3’r:5’-tcaatggagatgatttggtttc-3’反应体系如下(20μl)dna1μl擎科2xt3mix酶10μl正向引物f(10μm)1μl反向引物r(10μm)1μl补充双蒸水至20μl扩增条件如下：反应结束后，反应液于0.8％tae琼脂糖凝胶电泳。并对电泳条带进行回收纯化，方法同实施例2的第二步。对回收产物送样测序。在靶点附近出现多态性条带的为阳性植株，否则为隐性植株。如图3、图4(图3、图4中深色部分对应的碱基序列为靶点序列)。3.对敲除植株的进一步检测3.1将发生敲除的单株，对上一步回收的pcr产物进行bp反应。bp反应(gateway系统)体系如下：bpclonase1μldna回收片段(bp)3μl入门载体pdonr2211μl25℃反应8小时、过夜。3.2大肠杆菌感受态的制备(无菌操作)(1)取dh5a菌种接种于20mllb液体培养基中，37℃摇床培养过夜；(2)按1∶100接种于50mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，od600值为0.4-0.6；(3)将菌液放置在冰上30min；(4)4℃下4200rpm离心10min，弃上清，加10ml预冷的0.1m的cacl2悬浮菌体；(5)将菌液放置在冰上10min；(6)4℃下4200rpm离心10min，弃上清，加2ml预冷的0.1m的cacl2悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。3.3大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)(1)将1-5μl质粒dna或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；(2)42℃温水浴热激90s，立即冰浴2-3min；(3)加入1mllb培养基，37℃培养40-50min；(4)室温下4000rpm离心3min，收集菌体；(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。3.4取不同敲除单株的10个以上单菌落，根据其敲除载体分别以：target1检测引物序列：f：5’-gttcgatacgatgtcgaatctga-3’target2检测引物序列：f：5’-caaaaggagagccgtggtt-3’送公司测序。对测序结果用seqman进行比对，通过比对结果就可明确各敲除单株的具体敲除情况。如图5为完全敲除植株测序比对情况，图6为部分敲除植株测序比对情况。4.敲除效率我们对两个敲除靶点分别构建载体，在含有敲除载体的阳性植株中，靶点1发生敲除的概率为28％，完全敲除的概率为2％；靶点2发生敲除的概率为37％，完全敲除的概率为5％。具体统计情况见表1和表2。表1靶点1的敲除情况表2靶点2的敲除情况实施例6：雄性不育系和保持系的筛选通过测序检测的阳性植株，在开花期完全敲除株就会表现出雄性不育，如图7、图8。同时以完全敲除的不育株为母本，以部分敲除的可育株为父本，进行杂交，杂交的f1代会出现不同的分离现象，选取杂交后代可育株和不育株比例为1:1的组合，再用可育株与不育株再进行杂交，后代同样会出现一半不育株和一半可育株，其不育株即为不育系，可育株为保持系。通过该法就创造出了不育系和保持系。sequencelisting<110>山东省农作物种质资源中心<120>一种获得油菜细胞核雄性不育系的方法<130>山东省农作物种质资源中心<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>序列<400>1aggaagagaggagaaagta19<210>2<211>19<212>dna<213>序列<400>2gatggttaagcaaacacaa19<210>3<211>2775<212>dna<213>序列<400>3atgtcgaatctgattcgaacagatcttccaaagaagaggaagagaggagaaagtacggtt60tttaggctgaagactttcggagagacaggacatcccgctgagctgaaccagttgtctttt120agagacaaccttgggaagcttcttgagtttggtcactttgagagctccggtctcatggga180agttggtcctttcagctcgaggttcatcgtcacccaaatcctctatatgttcttctcttt240gtcgtcgaagagcccatcgaagcctctcttaacctccgttgcaaccattgccaatatgtt300ggtgacgtcatctccctctttctctccacttctctcattgtctatatatattttgcatat360cgatatctatctatctatatgtgtgtgtgcatgctgatacatccataatatgatcaacga420tcacaacgtaacaataaaaagacctgataagataatttagctcaacgagtaagcattttt480cgttgcatatctatgaaaaatataacaagcggaaaaaaaaatgatatggtgatccaagag540tgttggaggctcaacctcttttagaaggatgatagtttcattgattcaaatttcatatgt600taattttaatatgttacatgtaataggtcaacaatatgtattatgcatttatttatggaa660cattacaggttggggaaaccacatgatatgcaacaagaagtaccatttcgtgatcccctc720aaaggaaacaatggccgcctttctaaaactagaaggaggaatcttggtttctcccgaaaa780agaaagcctctcccatcttgtggaacttcaaggccatgtcctccacggctttttccactc840caacggatttggtcacttgctctcaatcaatggcatcgagtccggttccgacttaaccgg900tcatcaagtcatggagttgtgggatcgcctctgctctggtttaaaggccaggtatacgta960ttaagattataattatcatcttttatatttgtatacgttgtgcaatgttcacgtgataca1020tatcatatggtactaaaccattcagcagaattctatgacttgtcataaataataaagttt1080ggatttttaaccatttaattcatggtagtcaagtgctttgaagattcaacacatggttga1140gagcaatttcaaccatactagtaaatttgttaactcaagaaaccaccactttatagaact1200tgggacgaaattctggattttagtttcgaattatagatattattcgaattttctcttttg1260cttttagttataaatttcacatattaggccattttattagaaatggtaacaattatttgt1320atcttattatgttatggtatatatgttggatataggaaaatagggttgaacgatgcatcg1380cacaagaaagggatggaactgaggctgctgcatggagtagcaaaaggagagccgtggttc1440ggtcgttggggttaccggttcgggtcagggacatacggagtgactcaaaagatttacgag1500aaggcacttgagtcggtccgcaacgtacccttgtgtttgcttaaccatcacctaaccagc1560cttaaccgtgagactccaatcctcttgtcaaggtatcaaactttatccaccgagccattg1620attactctcagtgatctcttcatgttcatgcttcatctccattcgcgtcttccaagagac1680aactacatgaataactcccgaaaccaaatcatctccattgatagtaccaactgtagatgg1740tctcaaaaacggattcaaatggctattaaagtggttatagagtctttgaaaagggtcgaa1800tgccggtggatatcgagacaagaagtgagggacgcagctagaaattacatcggggacacg1860ggtttgcttgacttcgtgttgaagtcgctcggtaaccaagtggtcgggaactatttggtc1920cgacgtagtctaaacccggtgaagaaagtgctagagtattgcttggaggacatatcaaat1980ttattaccaagtagtaaccatgaactcacaacccttcaaaatcaatatcaaatggggaag2040actactaccacgacgaacggacataacaagatcacaagaggtcaagtgatgaaagacttg2100gtatacttttacaaacacattcttatggactacaagggagtgttaggccccataggcata2160ttgaaccaaatcggaatggcttcaagggctatcctcgacgctaagtacttcatcaaagag2220tatcactacatcagagatacattgatgaaaacaattcagttagatggaggtggcaaatta2280ggaatattctgcacaatcgcgtggaaatctcatcatcataacaacgacataaagatgcct2340ccacaagaatgcatagtggtgaacaagaatgcaacaatgagtgaagtgtatagagaggca2400gagagagtgttcagagagatctattgggaactaagagacgtcgtggtggataatcaaagg2460gagatggctccatgggtcgatgaaatggcattgaatgggaacaaaggattggtgttagat2520gggaatgtaggagtgatgatgaacattgaagtgatgaagtattatgatgatgaagatagt2580aagaagaaggataagaggatcgagtgtgaatgtggagcgaaggaggaagatggagagagg2640atggtgtgttgtgatatttgtgaagtatggcaacacacaaggtgtgttggtgttcaacat2700aacgaggaagttcctcgcatttttctttgtcaaagctgtgatcaacatcttattcctctc2760tcttttttgccttga2775<210>4<211>2795<212>dna<213>序列<400>4atgtcgaatctgattcaaacagatcttccaaagaagaggaagagaggagaaagtagggtt60tttaggctgaagacattcggagagacaggacacccagctgagatgaaccagttctctttt120agagacaaccttgggaagcttcttgagtttggtcactttgagagctctggtctcatggga180agttggtcctttcagctcgaggttcatcgtcacccaaatcctctctatgttcttctcttt240gtcgtcgaagagcccatcgaagcctctcttaacctccgttgcaaccattgccaatatgtt300ggtgacgtcatctccctctttctctccacttctctcattgtctatatatatatttgcata360tcgatatatatatgtgtgtgcatgctgatacatccataaatatgatcaacgatcacaacg420taacaatagaaagaactgataagatgatttagctcaacgagtaagcatttttcgttgcat480atctatgaaaaatataacaagcggaaaaaaattgatatggtaatccaagagtacggaggg540ccggaggctcaacctcttttagaaggatgatagtttcattgattcaaatttcatatgtca600attttaatatgttacatgtaataggtcaaaaatatgtattatgcatttatttatgcaaca660ttataggttggggaaaccacatgatatgcaacaagaagtaccatttcgtgatcccctcaa720aggaaacaatggccgcctttctaaaactagaaggaggaatctgcgcttctcccgaaaaag780aaagtctctcccatcttgtggaacttcaaggccatgtccttcacggctttttccactcca840acggatttggtcacttgctctctatcaatggcatcgagtccggttccgatctgaccggtc900accaagtcatggagttgtgggatcgcctctgctctggtttaaaggccaggtatgcgtatt960aagattataattatcatccttaatcctttatatttgtatacgttgtgcaatgttcacgtg1020atacatatcatatggtatataattaaaccatttaacagaattctattacttgtcataaat1080actaaagtattggatttttaaccatttaattcatggtagtcaagtggtttgaagattcaa1140cacatggttaagagcaatttcaatcatactagtaactttgtaaactcaagaaaccaccac1200ttacatagaacttgggacgaaattctggattttaatttcgaattgtagatattattggaa1260atttctcttttgcttttagttataaattttacatatttggccattttattagaaatggta1320acaattatttgtatcttattatgttatggtatataactatatatgttggatataggaaaa1380tagggttgaacgatgcatcgcacaagaaagggatggaactgaggctgctgcatggagtag1440caaaaggagagccgtggttcggtcgttggggttaccggttcgggtcagggacatacggag1500tgactcaaaagatctatgagaaggcacttgagtcggtccgcaacgtacccttgtgtttgc1560ttaaccatcacctaaccagccttaaccgtgagactccaattctcttgtcaaggtatcaaa1620ctttatccaccgagccattgatcactctcagtgatctcttcatgttcatgcttcatctcc1680attcgcgtcttccaagagataactacatgaataactcccgaaaccaaatcatctccattg1740atagtaccaactgaagatggtctcaaaaacggattcaaatggctattaaagtggttatag1800agtcgttgaaaagggtcgaatgccggtggatatcgagacaagaagtgagggacgcagcta1860gaaactacatcggggacacgggtttgcttgattttgtgttgaagtcgctcggtaaccaag1920tggtcgggaactatttggtccgacgtagtctaaatccggtgaagaaggtgctggagtatt1980gcttggaggacatatcaaatttattaccaagtactaaccatgaactcacaacccttcaaa2040atcaatatcaaatggggaagacgactacagccacgaacggacacaacaagatcacaagag2100gtcaagtgatgaaagacatggtctacttttacagacacattcttatggactacaagggag2160tgttaggccccataggcatattgaaccaaatcggaatggcgtcaagggcaatcctcgacg2220ctaaatacttcatcaaagagtatcactacatgagagatacaacaatgaaaacaattcagt2280tagatggcggtggaaaattaggaatattctgcacaatcgcgtggaaatcccatcatcata2340acaatgacataaagatgcctccacaagaatgcatagtggtgagcaaaagtgcaacaatga2400gtgaagtgtgtagagaggcagagagagtgtttagagagatctattgggaactaagagacg2460tcgtggtggataatcaaagggagatgactacaagggtcgatgaaatggcactgaatggga2520acaaaggattggtgttagatgggaatgtaggagtgatgatgaacattgaagtgatgaagt2580attatgatgatgaagatagtaagaagaaggataagaggatcgagtgtgaatgtggagcga2640aggaggaggatggggagaggatggtgtgttgtgatatttgtgaagtatggcaacacacaa2700ggtgtgttggtgttcaacacaatgaggaggttcctcgcatttttctttgtcaaagctgtg2760accaacaacttattcctctctcttttttgccttga2795<210>5<211>667<212>prt<213>蛋白质序列<400>5metserasnleuileargthraspleuprolyslysarglysarggly151015gluserthrvalpheargleulysthrpheglygluthrglyhispro202530alagluleuasnglnleuserpheargaspasnleuglylysleuleu354045glupheglyhisphegluserserglyleumetglysertrpserphe505560glnle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