识别人巨细胞病毒pp65抗原的TCR的制作方法

本发明涉及t细胞抗原受体技术领域，尤其涉及能特异性识别并结合人巨细胞病毒pp65抗原的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

背景技术：

人体内的t淋巴细胞是人体获得性免疫系统的重要组成部分。t细胞可以特异性的识别并杀伤被病原体感染或发生恶性转化的细胞。t细胞对感染细胞或癌细胞的识别依赖于其细胞膜表面tcr与靶细胞表面主要组织相容性蛋白(mhc)-抗原多肽复合物的特异性结合。人类的mhc又被称为人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)，广泛表达于人体有核细胞表面，在免疫系统辨别自体和外源分子的过程中起重要作用。t细胞对靶细胞的杀伤依赖于：1.tcr可识别并结合特定hla蛋白分子呈递的抗原多肽，该结合具有hla依赖的抗原特异性；2.tcr与抗原多肽-hla复合物的结合可促发t细胞内的信号级联反应，激活t细胞的细胞毒性功能。

上述抗原多肽可在靶细胞内生成。在细胞胞质中，抗原经蛋白酶体降解为8到15个氨基酸的多肽，这些短肽运输至内质网与hla分子结合，然后再经高尔基体运送至细胞膜表面。例如，肿瘤细胞可产生各类肿瘤抗原，包括肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、突变抗原以及病毒相关抗原。这些抗原在肿瘤细胞内可被降解成短肽并与hla形成复合物表达于细胞表面，从而被人体t细胞识别。因此这类多肽-hla复合物可作为t细胞识别、杀伤、治疗肿瘤的靶点。

人巨细胞病毒(cmv)是一种广泛存在的疱疹病毒，其在成人群体中的感染率为50％-100％。在免疫系统正常的个体中，cmv的感染通常不显示任何症状。但在免疫系统被抑制的个体中，如艾滋病患者或接受了器官移植的患者，cmv的再度活化可导致严重甚至致死性疾病(ulrikegerdemann，etal.molther，2013，21(11)：2113-2121)。此外cmv的感染与脑神经胶质瘤相关。在新诊断的多形性胶质细胞瘤组织切片中，cmv-pp65抗原的表达率为51％(25/49)，且该抗原在癌旁正常细胞中无表达(kennethg.lucas，etal.jneurooncol，2011，103：231-238)。此外，有临床i期研究显示cmv-pp65疫苗可延长脑胶质瘤患者的无进展生存期及总体生存率(kristena.batich，etal.clincancerres，2017，23(8)：1898-1909)。因此，靶向cmv-pp65的tcr可用于治疗cmv感染及cmv相关的恶性肿瘤。

tcr基因修饰的t细胞过继免疫治疗通过将可特异性识别肿瘤/病毒多肽-hla复合物的tcr基因转入健康人或患者的t细胞内，使这些原本没有抗原识别能力的t细胞获得识别并杀伤靶细胞的能力。因此，分离并鉴定出能特异性识别目标多肽-hla复合物的tcr即可构建tcr基因修饰t细胞，用于靶向并杀伤表达目标抗原的癌细胞或病原体感染的细胞。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能识别并结合hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

所述hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a2及cmv-pp65495-503短肽(天然序列：nlvpmvatv或突变序列：nlvpivatv)组成，表达于目标靶细胞表面。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明的第一方面，提供一种识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr，所述tcr具有结合hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物的特性，所述tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；

所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为cavteargaqklvf(seqidno：7)，

和/或所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为casrdglaglsyeqyf(seqidno：10)。

优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：seqidno：5，

αcdr2：seqidno：6，

αcdr3：seqidno：7。

更优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：seqidno：11，

αcdr2：seqidno：12，

αcdr3：seqidno：13。

优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：seqidno：8，

βcdr2：seqidno：9，

βcdr3：seqidno：10。

更优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：seqidno：14，

βcdr2：seqidno：15，

βcdr3：seqidno：16。

优选的，以上所述的识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seqidno：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

优选的，以上所述的识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr，所述tcrβ链可变区的氨基酸序列为与seqidno：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

本发明的另一方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码以上任一所述tcr的核苷酸序列或其互补序列。

优选的，所述核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seqidno：3，和/或包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seqidno：4。

本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体含有以上任一所述的核酸分子。

优选的，所述载体为病毒载体。

更优选的，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞转导以上任一所述核酸分子或以上任一所述载体，该细胞可表达结合hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物的特异性tcr。

优选的，所述细胞为t细胞或干细胞。

本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含以上任一所述的tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体或以上任一所述的细胞作为活性成分。

本发明的另一方面，以上任一所述的tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体、以上任一所述的细胞、以上任一所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物。

优选的，以上任一所述的tcr、任一所述的核酸分子、任一所述的载体、任一所述的细胞、任一所述的药物组合物分别用于制备治疗脑胶质瘤或cmv病毒感染的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了能识别并结合hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物的用途。

附图说明

图1为流式细胞术检测分离、扩增后得到的hla-a2-cmv-pp65495-503特异性t细胞克隆a6；

图2为插入逆转录病毒载体的tcr序列元件示意图；

图3为流式细胞术检测识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr基因修饰t细胞(a6tcr-t细胞)的转导效率；

图4为流式细胞术检测a6tcr-t细胞与靶细胞共培养后具有特异性释放细胞因子及发挥细胞毒性功能的能力；

图5为elisa检测a6tcr-t细胞与表达pp65的脑胶质瘤细胞系(u87及t98)(hla-a2+)共培养后释放细胞因子的能力。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。以下实施例的主要目的是用于进一步介绍本发明方法的具体实施过程，不代表本发明方法仅能按以下实施例实现。

实施例1：hla-a2-cmv-pp65495-503特异性t细胞的克隆及测序

利用化学合成的短肽nlvpmvatv(生工生物工程(上海)股份有限公司)刺激来源于hla-a2基因型的健康志愿者的外周血单个核细胞(pbmc)。经2轮多肽刺激后，elisa检测多克隆t细胞与负载nlvpmvatv短肽的t2细胞(靶细胞)或负载非目标短肽的t2细胞(对照细胞)的反应性(检测指标为细胞因子ifn-γ的释放)。将阳性多克隆t细胞(靶细胞od450-对照细胞od450＞1.0)进行有限稀释克隆(1细胞/孔、3细胞/孔或5细胞/孔)，14天后elisa检测有限稀释后各孔t细胞与靶细胞的反应性。挑取阳性单克隆t细胞进行扩增。扩增14天后，用鼠抗人cd8抗体(bdbiosciences)及hla-a2-cmv-pp65495-503四聚体染色(mbl)对t细胞进行检测，经流式细胞仪分选出cd8阳性且四聚体阳性的目标t细胞群(t细胞克隆a6)，如图1所示。

采用rneasyminikit(qiagen)抽提2×10⁶a6t细胞的rna。通过5’race(smarterrace5’/3’kit，clontech)分别合成tcrα及β序列。首先采用tcr恒定区特异的引物tcr-a-c(5’-gccacagcactgttgctcttgaagtcc-3’)及tcr-b-c(5’-caggcagtatctggagtcattgag-3’)替换试剂盒中的引物5’-cdsprimera，其余操作按试剂盒说明进行。合成cdna后通过两轮pcr扩增目标tcr的α及β链，第一轮pcr采用的引物分别为upm(试剂盒自带)及tcr-a-c或tcr-b-c。反应条件如下：94℃3min；94℃15s，60℃30s，72℃1min(25个循环)；72℃5min。取1μlpcr产物进行第二次pcr扩增，引物分别为upm(试剂盒自带)及tcr-a-c-n(5’-ctcagctggtacacggcagggtcagg-3’)或tcr-b-c-n(5’-gagtcattgagggcgggctgctcc-3’)。反应条件与第一轮pcr相同。上述所得的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，切胶回收后ta克隆至2.1载体(takit，invitrogen)，连接产物转化化学感受态大肠杆菌stbl3细胞(invitrogen)。第二天，挑取单菌落进行测序。

分别挑取10个含tcrα链及tcrβ链的单菌落送测序，有效的测序结果显示tcrα链及tcrβ链序列分别为单一相同序列，其中，

tcrα链可变区氨基酸序列为seqidno：1。

tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：drgsqs(seqidno：5)，

αcdr2：iysngd(seqidno：6)，

αcdr3：cavteargaqklvf(seqidno：7)。

tcrα链可变区核苷酸序列为seqidno：3。

tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：gaccgaggttcccagtcc(seqidno：11)，

αcdr2：atatactccaatggtgac(seqidno：12)，

αcdr3：tgtgccgtgacagaagcgaggggagcccagaagctggtattt(seqidno：13)。

tcrβ链可变区氨基酸序列为seqidno：2。

tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：mnhey(seqidno：8)，

βcdr2：svgegt(seqidno：9)，

βcdr3：casrdglaglsyeqyf(seqidno：10)。

tcrβ链可变区核苷酸序列为seqidno：4。

tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：atgaaccatgaatac(seqidno：14)，

βcdr2：tcagttggtgagggtaca(seqidno：15)，

βcdr3：tgtgccagcagggacggactagcgggtctctcctacgagcagtacttc(seqidno：16)。

实施例2：制备hla-a2-cmv-pp65495-503特异性tcr基因修饰的t细胞

将上述克隆得到的目标tcr序列插入逆转录病毒载体pmsgv1中(addgene)构建可表达该tcr的pmsgv1-a6tcr载体。tcr序列元件如图2所示。通过转染293gp包装细胞pmsgv1-a6tcr及pvsv-g质粒载体制备逆转录病毒并采用病毒上清转导t细胞，具体操作如下：

细胞转染：第0天将293gp细胞接种至6孔板(6x10⁵/孔)；第1天，pmsgv1-a6tcr及pvsv-g质粒共同转染293gp细胞(2μgpmsgv1-a6tcr及1.4μgpvsv-g/孔)。同一天，采用抗人cd3抗体(okt3)活化健康人的pbmc；第3天，收集含病毒上清的293gp培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的dmem培养液)至293gp细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的t细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的t细胞；第5天将转染后的t细胞收集至t25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300u/mlil2的x-vivo(lonza))。

第10天流式细胞术检测目标tcr的表达水平，如图3所示，tcr的转导效率(四聚体染色的阳性率)为44.5％。

实施例3：hla-a2-cmv-pp65495-503特异性tcr基因修饰t细胞的体外功能验证

流式细胞术分析：靶细胞的制备如下，将负载目标cmv-pp65495-503多肽(天然多肽或含单个氨基酸突变的多肽)及非目标多肽ebv-lmp2a237-245的t2细胞(hla-a2阳性)与tcr-t细胞于37℃共培养4小时后，流式细胞术检测t细胞的细胞毒性功能标志物cd107a及细胞因子ifn-γ的变化，如图4所示，hla-a2-cmv-pp65495-503特异性tcr基因修饰t细胞可特异性识别靶细胞，释放细胞因子并发挥细胞毒性功能。

elisa检测：靶细胞的制备如下，将表达cmv-pp65全长基因的质粒转染脑胶质瘤细胞系u87(hla-a2阳性)及t98(hla-a2阳性)制备稳定转染并表达cmv-pp65蛋白的细胞系u87-pp65及t98-pp65。将靶细胞，野生型u87及t98细胞分别与tcr-t细胞进行共培养(37℃，16h)，取上清检测ifn-γ的释放量，如图5所示，tcr-t细胞不识别野生型u87及t98细胞系，但当该细胞系表达抗原pp65时，pp65可经细胞内分解并形成表达于细胞表面的hla-a2-cmv-pp65495-503抗原复合物，从而被所述tcr-t细胞特异性识别并杀伤。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110>深圳因诺免疫有限公司；深圳市因诺转化医学研究院

<120>识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr

<130>20190621

<141>2019-07-17

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>人(homosapiens)

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151015

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202530

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354045

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100105110

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<400>2

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151015

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202530

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100105110

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115

<210>3

<211>336

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<213>人(homosapiens)

<400>3

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15

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15

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<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>16

tgtgccagcagggacggactagcgggtctctcctacgagcagtacttc48