PCV3Cap蛋白B细胞线性抗原表位多肽及其筛选与应用的制作方法

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及一种可以鉴别pcv3cap单克隆抗体的pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位多肽及其筛选与应用。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircoviruses,pcv)是目前对世界养猪业危害最为严重的疾病之一。目前，该病毒包括三种不同的类型：猪圆环病毒1型(porcinecircoviruses1,pcv1)、猪圆环病毒2型(porcinecircoviruses2,pcv2)和猪圆环病毒3型(porcinecircoviruses3,pcv3)。其中pcv1被证实无致病性；pcv2具有较强的致病性，常引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（pmws）；pcv3作为一种新型圆环病毒自2016年在美国首次报道以来，先后在中国、韩国、泰国等亚洲地区及波兰、意大利、德国等欧洲地区多个国家均有报道，该病原已在世界范围内流行，并且常与pcv2混合感染，加重了疾病的症状，增加了疫病的防控难度，加大了养猪业的经济损失。

抗原表位（epitope）是病毒结构蛋白的重要元件，其蛋白分子量较小且常被机体的淋巴细胞所识别，因此被称为抗原决定簇，通常由5～17个氨基酸残基组成，在诱导和细胞介导的病毒免疫反应中发挥重要作用。根据其受体不同，表位分为b细胞表位和t细胞表位；其结构不同，表位又分为线性表位和构象表位。抗原表位的研究对于完善病毒蛋白结构及病毒与宿主作用关系的研究意义重大，同时对病毒的检测，表位疫苗的制备提供材料基础应用价值巨大。

由于pcv3属于最近新发现的病毒株，临床上还没有效的防控手段。病毒在进化过程中，其本身为了逃逸机体的免疫监视，势必会进行相关氨基酸位点的突变，或者发生基因片段的重组，从而使得其在宿主内增殖。不论是关键氨基酸位点的突变还是基因片段的重组，其本质是病毒抗原表位的变异，其抗原表位不仅可以制备相应的检测试剂，还可以制备相关的亚单位疫苗，甚至根据其抗原表位制备相应的治疗抗体。

近年的研究表明，根据病毒的表位从而研发相应的诊断试剂，治疗抗体，新型的亚单位疫苗是可行的。然而如何获得合适的疫苗靶抗原及其表位，研制新型pcv3表位疫苗或药物是如今本领域技术人员所努力解决的技术难题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位多肽序列的筛选方法，通过生物信息学技术和免疫学方法预测及鉴定出pcv3cap蛋白的抗原表位，同时公开pcv3cap蛋白抗原表位的用途，以解决对pcv3cap蛋白细胞表位研究不足的技术问题。

本发明pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位的多肽序列，包括两条多肽，其氨基酸序列分别为：

pcv3cap47-62：nvisvgtpqnnkpwha；

pcv3cap136-149：tskkkhsryftpkp；

上述氨基酸的核苷酸序列分别为：

pcv3cap47-62：aacgtcatttccgttggaacccctcagaataacaagccctggcacgcc48；

pcv3cap136-149：acttctaaaaaaaaacacagccgttacttcacccccaaacca42。

本发明pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位的筛选方法，包括如下步骤：

（1）根据ncbi（genbank号：mh107162.1）上边公布的已知pcv3cap蛋白的氨基酸序列，比对分析pcv2与pcv3结构蛋白的主要差别，观察其氨基酸的保守性；

（2）通过dnastar7.0软件包中protean模块gamier-robson法和chou-fasman法及在线网站sopma法对pcv3cap蛋白二级结构特征进行了预测。同时采用kyte-doolitt法、emini法和jameson-wolf法对蛋白质骨架的亲水性区域、表面可及性、柔韧性和高抗原指数区域进行预测；

（3）借助抗原表位预测在线网站http://tools.iedb.org/bcell对pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位进行预测，同时使用https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/abc_submission.html网站对pcv3cap的抗原表位进行预测；

（4）通过对dnastar软件预测结果和在线网站预测的表位信息序列综合分析，为了最大限度地覆盖pcv3帽的抗原表位信息，采用随机重叠方式，少许多肽序列相互重叠，最终获得12个表位多肽信息，交由吉尔生化上海有限公司合成，多肽合成纯度大于95%并用bsa偶联；

（5）通过使用pcv3cap单克隆抗体与抗原表位多肽进行结合反应，最终筛选出于单抗特异性结合的短肽，获得两个pcv3cap的b细胞线性抗原表位，所获得的表位为含alpha、beta、turn、coil结构中的至少一种，富含正电荷，亲水性强，表面可及性强，抗原指数高；

两条多肽的其氨基酸序列分别为：

pcv3cap47-62：nvisvgtpqnnkpwha；

pcv3cap136-149：tskkkhsryftpkp。

本发明通过elisa的方法，利用pcv3cap单克隆抗体筛选出与抗体特异性结合的短肽，获得两个pcv3cap的b细胞线性抗原表位。筛选出的短肽，可以为将来制备pcv3的表位疫苗、新型诊断试剂及治疗pcv3感染的特异性抗体的研究等提供可靠依据。

本发明的优点在于，筛选出了两条pcv3capb细胞线性抗原表位多肽序列，多肽抗原性良好，抗原表位经pcv3cap单克隆抗体鉴定为pcv3cap所特有，且序列保守，有助于完善cap蛋白的抗原表位图谱和蛋白结构的解析。应用该多肽序列可以有效地鉴别诊断动物是否感染pcv3，为以后防治pcv3提供有效的检测手段，为pcv3表位疫苗的研究打下良好的技术基础，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例pcv3cap蛋白二级结构预测图；

图2为实施例pcv3cap蛋白亲水性区域、表面可及性、柔韧性和高抗原指数区域预测图；

图3为实施例pcv3cap抗原表位的生物信息学预测结果图；

图4为实施例pcv3cap单克隆抗体分别与12条抗原表位多肽的间接elisa结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例

pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位的多肽序列的筛选方法，包括如下步骤：

（1）根据ncbi上边公布的已知pcv3cap蛋白的氨基酸序列，比对分析pcv2与pcv3结构蛋白的主要差别，观察其氨基酸的保守性；

（2）通过dnastar7.0软件包中protean模块gamier-robson法和chou-fasman法及在线网站sopma法对pcv3cap蛋白二级结构特征进行了预测（预测结果如图1所示）；

根据gamier-robson方法预测，pcv3cap有17个β折叠区（59.8%）、19个β转角区（16.8%）和18个不规则卷曲区（20.6%）；根据chou-fasman方法预测，pcv3cap有3个α-螺旋区（12.1%）、8个β折叠区（41.1%）和14个β转角区（31.8%）；

根据sopma方法预测，不规则卷曲区（51.4%）、β折叠（27.57%）和α螺旋区（17.29%）。同时采用kyte-doolitt法、emini法和jameson-wolf法对cap蛋白质骨架的亲水性区域、表面可及性、柔韧性和高抗原指数区域进行预测（预测结果如图2所示）；

对cap蛋白柔韧性的分析表明，在肽链的aa9-21、25-27、32-37、39-44、52-59、95-102、115-120、122-133、135-142、146-150、153-162、168-172和192-204段中蛋白质骨架的韧性很强，推测该区域容易与抗体结合；

对cap蛋白的表面暴露概率的分析表明，aa6-25、31-44、53-61、67-72、79-84、96-101、116-146、155-159、167-179和191-196残基是cap蛋白n末端的主要区域，氨基酸在该区域的可及性大于1，该区域易与抗体结合，形成b细胞表位的概率较高；

对cap蛋白的亲水性分析表明，肽链的aa1-31、33-46、53-78、95-104、114-147、155-160、168-181和191-209区域通常位于蛋白质表面，容易形成表位；

分析cap的抗原指数：以大于0的抗原指数为标准，分析表明抗原高指数区域为aa5-45、52-61、68-74、95-103、109-113、119-151、155-160、168-178和191-208；

（3）借助抗原表位预测在线网站http://tools.iedb.org/bcell对pcv3cap蛋白b细胞线性抗原表位进行预测（预测结果如图3所示）；

使用软件对某一种蛋白进行预测，由于算法的不同，可能会漏测必要的抗原表位；

同时使用https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/abc_submission.html网站对pcv3cap的抗原表位进行预测（预测结果如表1所示）；该方法不同于其他软件预测方法，使用该软件可以将一段蛋白的序列进行打断，计算每一种多肽的亲水性、可及性等；

表1:https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/abc_submission.html网站对pcv3capb细胞抗原表位进行预测

（4）通过对dnastar软件预测结果和在线网站预测的表位信息序列综合分析，为了最大限度地覆盖pcv3cap的抗原表位信息，采用随机重叠方式，少许多肽序列相互重叠，最终获得12个表位多肽信息（如表2所示），交由吉尔生化上海有限公司合成，多肽合成纯度大于95%并用bsa偶联；

表2:pcv3capb细胞线性抗原表位信息

（5）pcv3cap单克隆抗体的制备

免疫原的准备：pcv3cap蛋白的核苷酸序列在genebank上的登录号为：mh107162.1。构建表达cap蛋白的pet-32a-cap重组载体，将重组表达载体pet-32a-cap转入e.colibl21（de3）感受态细胞，按照1%的比例将鉴定为阳性表达菌液加入到100ml含有100μg/ml氨苄青霉素lb液体培养基，置于37℃的摇床内，220rpm，培养4h后使用nanodrop™3300分光光度计检测表达菌液浓度，当od600达到0.6时，此时加入终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导表达4h，高速离心收集菌体并进行超声波破碎及his标签纯化试剂盒纯化；纯化后的pcv3cap蛋白经sds-page电泳检测，于-80℃保存备用。

动物免疫：取5只6周龄balb/c雌性小鼠作为免疫动物，免疫前每只小鼠通过尾静脉采血。将50μg的pcv3cap纯化蛋白与弗式完全佐剂乳化后通过腹腔注射的方式免疫小鼠（一只小鼠的剂量），免疫2周后通过尾静脉采血以及进行第2次免疫。第2次免疫与第1次免疫使用的蛋白量相同，佐剂换为弗式不完全佐剂进行乳化，同样于免疫2周后采血。第3、4次免疫与第2次免疫剂量、所使用佐剂相同。最后一次免疫2周后采血进行elisa检测，待抗体效价符合要求后进行细胞融合试验。

细胞融合：最后一次免疫5天后，用75cm²的细胞培养瓶培养sp2/0骨髓瘤细胞至贴壁；收集血清效价大于1：10000小鼠的脾脏获取脾细胞。将瘤细胞与脾细胞混合，混匀细胞后，800rpm离心10min。小心弃去上清液，将离心管底部的细胞轻轻拍散，之后在30s内加入1ml的peg溶液，边加边转动离心管，尽量将peg溶液加到细胞处，室温静置90s后加入30mldmem培养液。融合完成后，800rpm离心5min后小心弃去细胞上清液，之后使用30ml的hat培养基吹散细胞，将细胞液加入到铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔加100μl的细胞液，将96孔细胞培养板置于37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。

杂交瘤细胞筛选：以pcv3cap蛋白作为包被抗原，采用间接elisa的方法筛选阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行单克隆化，培养10天后筛选获得杂交瘤细胞单克隆，最终获得了4株分泌抗cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（c10b,b2d,a4c,d2c）。

单抗腹水制备：取6周龄的balb/c雌性小鼠，每只小鼠通过腹腔注射0.5ml的石蜡。将单克隆杂交瘤细胞通过腹腔注射的方式注射到小鼠体内，每天观察小鼠的状态，待小鼠腹部隆起用注射器收集腹水，4℃，800rpm离心10min收集中间腹水层，-80℃保存。

腹水效价检测：将所得腹水按照1:1000,1:2000,1:4000,1;8000;1:16000,1:32000,1:64000比列稀释，以cap蛋白作为包被抗原，通过间接elisa法对腹水测od值，采用过滤纯化腹水获得单克隆抗体。

（6）通过使用pcv3cap单克隆抗体与抗原表位多肽进行结合反应，最终筛选出与单抗特异性结合的短肽，获得两个pcv3cap的b细胞线性抗原表位，

鉴别pcv3cap单克隆抗体的间接elisa方法如下：

包被：将12条多肽使用包被缓冲液稀释成5μg/ml作为抗原备用，按照每孔50µl体积加入到elisa板中，放置4℃冰箱孵育过夜；

封闭：次日取出elisa板，将洗板机的程序设置为每孔200µl洗涤液，洗涤6遍，洗涤完后拍干，然后每孔添加200µl的5%脱脂奶粉封闭液（5g脱脂奶粉，100mlpbst），置于37℃温箱封闭2h；

一抗孵育：封闭结束后，使用洗板机洗涤3遍，用pbst按照1:1000的比例分别稀释pcv3cap单克隆抗体：c10b、b2d、a4c、d2c腹水，每孔添加100µl的稀释好的腹水，设spf级小鼠阴性血清为阴性对照，37℃温箱孵育2h。

二抗孵育：一抗孵育结束后，使用洗板机洗涤6遍，用pbst按照1:8000的比例稀释hrp标记羊抗鼠抗体作为二抗，每孔添加100µl的二抗，37℃温箱孵育0.5h。

显色液显色：二抗孵育结束后使用洗板机洗涤6遍，按照tmb显色试剂盒的说明配置显色液，每孔添加100µl的tmb显色液，37℃避光显色15min。

读数：显色完成后，每孔添加50µl2mol/l浓硫酸终止液（1.11ml浓硫酸加至10mlpbst），使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（od值）。

elisa反应结果如图4所示，结果显示4个单克隆抗体中的2个可以特异性识别出12个多肽中的2个，单克隆抗体c10b可以与由氨基酸残基cap47-62组成的抗原表位多肽反应，其od450读数为2.68；单克隆抗体b2d可以与由氨基酸残基cap136-149组成的抗原表位多肽反应，其od450读数为2.91。

序列表

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