一种组织蛋白酶S的底物、其应用和包含其的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种组织蛋白酶s的底物、其应用以及包含其的试剂盒。

背景技术：

干燥综合征(sjogren’ssyndrome)为全身性自身免疫疾病，在我国人群的患病率为0.3％～0.7％，在老年人群中患病率为3％～4％。本病女性多见，男女比为1：9～20。发病年龄多在40岁～50岁。也见于儿童。该疾病给患者带来不同程度的健康损害包括角膜结膜口腔极度干燥，多器官功能障碍，严重情况下可导致失明，甚至增加恶性淋巴瘤的发病率。目前干燥综合症仍然没有根治的方法，但及时就医确诊并使用相应的免疫调节药物可以使病情得到有效的控制。

目前有研究发现干燥综合征患者眼泪中组织蛋白酶s表达显著升高，使得通过检测组织蛋白酶s的含量来确诊干燥综合征成为可能。组织蛋白酶s能够切割特定的底物序列，基于此，其检测方法一般是在特定的底物序列上标记荧光基团，通过组织蛋白酶的切割释放该荧光基团以发光，并通过荧光检测仪器检测其荧光强度。现有组织蛋白酶s底物的特异性和催化活性仍不理想。

技术实现要素：

针对以上技术现状，本发明提供一种高特异性和催化活性的组织蛋白酶s的底物，并提供包含该底物的用于诊断干燥综合征的试剂盒。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

组织蛋白酶s特异性底物，名称为ac-pmkvr-amvtc，其中pmkvr为氨基酸序列：脯氨酸-蛋氨酸-赖氨酸-缬氨酸-精氨酸，该底物的结构如下式所示：

较同一家族的其它蛋白酶，组织蛋白酶s对该底物具有更强的特异性和催化活性(约为其他蛋白酶的100倍)，只需极少量的泪液样品即可精确检测组织蛋白酶s的活性，同时避免其他蛋白酶酶解带来的误差。该底物分子在激发光下不产生发射光，酶解后形成的产物分子7-氨基-4-甲基-3-乙烯甲苯香豆素(amvtc)可被393mn激发光激发产生480nm波长的蓝色荧光发射光，用于酶活性分析的定量物，该分子中的荧光基团具有接近完美的光子转换效率，其φ值为0.98，即该分子所吸收的98％的激发光子可以转换成发射光子。

本发明还提供上述底物在制备干燥综合征诊断试剂盒中的应用，通过该底物精确检测组织蛋白酶s的活性，以诊断患者是否患有干燥综合征。所述试剂盒中该底物原液浓度为10mm。

本发明还提供一种干燥综合征诊断试剂盒，包括上述底物，还包括酶反应溶液、组织蛋白酶s抑制剂、产物标准液和样品采集器。将泪液样品在含有底物的酶反应溶液中孵育，反应液的荧光强度与产物(7-氨基-4-甲基-3-乙烯甲苯香豆素，缩写为amvtc)标准液(0.1mm)的系列荧光强度制成的标准曲线进行对比而得到样品中组织蛋白酶s的活性，组织蛋白酶s抑制剂可选择性与组织蛋白酶s结合，使其失去催化活性，用于确认实验检测到的荧光强度由组织蛋白酶s所催化产生。

可选地，所述酶反应溶液中包括：50mm磷酸钾缓冲液，50mmnacl，2mmedta，0.01wt％tritonx-0.5mm二硫苏糖醇，ph6.5。

可选地，所述组织蛋白酶s抑制剂为1mm的z-fl-cocho或z-ff-fmk。

可选地，所述眼泪样品采集器为酚红棉线。本发明试剂盒可通过检测泪液中组织蛋白酶s的含量来诊断干燥综合征，用酚红棉线来吸取泪液比希尔默试纸条时间更短更方便。

附图说明

图1是本发明实施例2中标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供一种组织蛋白酶s的底物，名称为ac-pmkvr-amvtc，其结构如下式所示：

实施例2

一种干燥综合征诊断试剂盒，包括实施例1的底物溶液(10mm)，酶反应溶液、z-fl-cocho(1mm)、amvtc标准液(0.1mm)和酚红棉线。其中酶反应液中包括：50mm磷酸钾缓冲液，50mmnacl，2mmedta，0.01wt％tritonx-0.5mm二硫苏糖醇，ph6.5。酚红棉线上刻有刻度，吸取泪液后取2mm作为样品即可。

该试剂盒的使用方法如下：

配制浓度分别为0、200pmol/100μl、400pmol/100μl、600pmol/100μl、800pmol/100μl、1000pmol/100μl和1200pmol/100μl的amvtc标准液，使用荧光酶标仪测定以上各已知浓度的amvtc溶液的荧光蓝色强度(激发光393nm/发射光480nm)。然后用测得的荧光强度对已知浓度做标准曲线，结果如图1所示。

用酚红棉线吸取泪液，酚红棉线上具有刻度，吸取泪液后剪下2mm放入1.5ml或0.6ml的eppendorf管底部，加入含有0.2mm底物的100μl酶反应溶液，使酚红棉线完全被淹没，37℃反应1-2h，将反应液转移到96孔平板(使用底部平且透明，孔壁黑色的平板)，使用荧光定量测定仪在激发光393nm、发射光480nm的波长下测定反应液的荧光强度。

在以上进行酶学反应的同时需要设定平行的空白对照。空白反应管中除去不含泪液样本外其它所有成分与以上样本管相同。

另取吸取同一来源泪液的酚红棉线样品2mm采用上述相同的方法，不同之处在于在加入底物之前先将2μl(1mm)组织蛋白酶s抑制剂z-fl-cocho加入到98μl酶反应溶液中，混匀，然后加入10mm的实施例1所述底物至其终浓度为0.2mm，相同的反应条件下反应，将反应液转移到96孔平板，在相同的波长下测定反应液的荧光强度是否与空白对照相似或接近。若与空白相同，说明上述不加抑制剂测得的荧光强度全部由样品中组织蛋白酶s的作用所产生，将该荧光强度根据标准曲线计算即可得出样品中组织蛋白酶s的活性0。采用本实施例2试剂盒，加入抑制剂后测得荧光强度均与空白对照相似，也从另一个角度说明本发明的底物对组织蛋白酶s具有高度的特异性。

吸取泪液的酚红棉线可立即进行测定，或放入1.5ml的冷冻管中，在-80℃下冻存，一周内进行检测酶活性均无明显变化。

试验例1

1、特异性试验

(1)取分别含有等量组织蛋白酶b、h、k、l、s的标准样品，按照实施例2的方法进行酶活测定。组织蛋白酶b、h、k、l、s标准品可从美国公司biovision购买。实验显示，仅含有组织蛋白酶s的样品有蓝色荧光出现，其他样品均不发射荧光。结果说明除酶s外其它几个家族成员基本不识别该底物。

(2)取组织蛋白酶s标准样品(记为样品1)，另取含有等量组织蛋白酶s并含有组织蛋白酶b、h、k、l的混合标准样品(记为样品2)，按照实施例2的方法进行酶活测定，结果显示，样品1和样品2的荧光强度基本相同。结果进一步说明除组织蛋白酶s外其它几个家族成员基本不识别该底物，也对组织蛋白酶s没有促进作用。

(3)取泪液样本，按照实施例2的方法进行组织蛋白酶s活性抑制测定。组织蛋白酶b、h、k、l的特异性抑制剂可从美国公司biovision或英国公司abcam购入。包括5种抑制剂的酶活性测定同时进行。结果显示，仅含有组织蛋白酶s抑制剂的样品不再产生蓝色荧光，而b、h、k、l的抑制剂基本不影响泪液样本产生的荧光强度。此实验说明1)该试剂盒所用底物高度特异，不被其它几个家族成员所催化形成产物或/和2)泪液中基本不存在其它以上几种家族成员针对该底物的酶活性，所有荧光产物分子由酶s催化产生。

2、检测限试验

有关该试剂盒的可检测酶活性最低限(detectionlimit)：检测最低限即为检测仪器的灵敏度。空白本底值与同一标准样本多次测定数值的重复性可用于衡量任何一种酶标仪的灵敏度(sensitivity)是否合格。本发明中的实验系列使用的是美国awarenessstatfax2100酶标仪。该仪器的可检测最低限为0.4pmol/100μl。以下为仪器所检测最低限的计算方法和过程：

1)计算酶标仪灵敏度的公式：仪器可检测最低值＝3x空白荧光标准差(stdevb)x标准物每孔浓度*(pmol/100μl)/标准物荧光均值(meanofstandard)–空白荧光均值(meanofblank)

*标准物：amvtc

2)应用标准物捡测数据代入以上公式运算：仪器可检测最低值＝3x空白荧光标准差(8)x标准物浓度(200pmol/100μl)/标准物荧光均值(12093)–空白荧光均值(50)＝0.4pmol/100μl。

以上公式中的数值说明：根据本发明的仪器测试结果，在反应溶液中不含泪液的条件下空白孔10次的荧光读数的均值为50±8。

仪器测试结论：本发明使用的酶标仪的可检测最低限0.4pmol为正常泪液催化产生荧光产物的最低值40pmol的1/100。该仪器的灵敏度故完全满足临床样本组织蛋白酶s活性检定的要求。

3、酶标仪线性动态范围(dynamicrange)

通过测定梯度稀释的标准物amvtc浓度和制作曲线，得到所使用的酶标仪测定amvtc的线性浓度动态范围可达5x10³(0.4–2000pmol/100μl)。线性范围内包含的所有amvtc浓度都与其相对应的荧光强度成直线型关系。

4、精密度试验

变异系数(coefficientofvariation)：是评价酶标仪精密度一个重要指标。由重复测定同一样本所得的荧光强度的均值与其标准差比值的百分数，即变异系数＝标准物荧光强度标准差(n)÷标准物荧光强度均值(n)x100％。公式中”n”代表同一标准物样本重复测定n次。数值越小说明仪器越稳定，重复性越好，即精密度越高。发明人所使用的酶标仪的10次荧光标准物amvtc测定值的变异系数为±2.5％，符合常规生物学实验对精密度的要求(≤10％)。

试验例2

采用实施例2的试剂盒对200例已确诊患有干燥综合征的患者以及200例正常人的泪液进行测定，临床泪液检测结果总结如下：组织蛋白酶s在每份正常泪液样本催化底物产生的荧光产物的均值为67pmol/100μl(4126rfu)。具有最高酶活性的正常泪液样本所产生的荧光产物量为94pmol/100μl(5712rfu)；具有最低酶活性的正常泪液样本所产生的荧光产物量为40pmol/100μl(2501rfu)。干燥综合症病人的每份眼泪样本所产生的荧光产物的平均值约为365pmol/100μl(21985rfu)，具有最高酶活性的病人泪液样本所产生的荧光产物量为968pmol/100μl(58115rfu)；具有最低酶活性的病人泪液样本所产生的荧光产物量为141pmol/100μl(8539rfu)。所有数值均落在该仪器的可测定值线性范围内(0.4–2000pmol)。应用统计学方法(ttest)对患者和正常人两组数据检验的结果显示两组间具有明显差异(p<<0.001)。根据这一实验结果，可初步确定干燥综合征的阳性标准：在7000rfu以上考虑有干燥综合征的可能性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。