一种地龙蛋白肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于蚯蚓深加工技术领域，尤其涉及一种地龙蛋白肽及其制备方法和应用。

背景技术：

地龙，即蚯蚓，是我国重要中药材之一，在《神农本草经》中列为下品，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效。地龙体内富含蛋白质，以干体计，蛋白含量为56～66％，为大豆的1.5倍，稻谷的6倍。地龙蛋白质中含有多种游离氨基酸，它们是地龙最主要的营养成分。其蛋白质由18种氨基酸组成，其中以亮氨酸和谷氨酸的含量最高，每百克样品分别含22.161克和6.227克，其次有天冬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氯酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸和酪氨酸等，包括了人体必需的8种游离氨基酸。蚯蚓是一种全价动物性蛋白源。

地龙蛋白肽是将地龙蛋白进行进一步的水解和纯化获得的小分子多肽，现有的地龙蛋白肽多采用生物酶解的方法，例如中国专利cn107760747a中公开了以地龙蛋白为原料，采用风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶多酶酶解，然后通过灭酶、离心、过滤、浓缩、脱色和喷雾干燥等工序，制得地龙蛋白活性肽。提取条件苛刻，操作复杂，成本高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、纯度高的地龙蛋白肽及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种地龙蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：1)将地龙蛋白与柠檬酸水溶液混合后，0～20℃提取4～8h，获得提取料液；2)将所述提取料液进行固液分离，收集液相组分获得提取清液；3)将所述提取清液依次经过超滤、有机膜过滤获得滤液；4)将所述滤液经过液相色谱纯化、干燥获得地龙蛋白多肽。

优选的，步骤1)中所述柠檬酸水溶液的浓度为0.45～0.55mol/l。

优选的，步骤1)中所述地龙蛋白与柠檬酸水溶液的质量比为1：(13～18)。

优选的，步骤3)中所述超滤为陶瓷膜超滤，所述陶瓷膜的孔径为0.8～1.2μm。

优选的，步骤3)中所述有机膜的截留分子量为10000d。

优选的，步骤3)中所述超滤和有机膜过滤的温度独立为24～26℃。

优选的，步骤2)中所述提取清液中固含量为4～6％。

优选的，步骤4)中所述干燥为冷冻干燥。

本发明提供了所述制备方法制备获得的地龙蛋白肽。

本发明提供了所述制备方法制备获得的地龙蛋白肽在制备预防血栓药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的一种地龙蛋白肽的制备方法，将地龙蛋白与柠檬酸混合进行提取，提取获得的地龙蛋白肽中富含纤溶蛋白溶解酶，使血栓中的纤溶蛋白溶解酶元转化成具有活性的纤溶蛋白溶解酶，从而溶解血栓中的纤维蛋白，也可直接溶解血栓，并且在溶解血栓的同时不会影响体内的凝血机制；本发明中所述地龙蛋白肽制备过程中的温度较低，最大限度的保留地龙蛋白的活性，使之不受破坏；同时采用了制备型工业液相色谱进行纯化，使地龙蛋白肽活性纯度更高；本发明中使用柠檬酸制取活性地龙蛋白肽，工艺简单，可操作性高，原料易得，适合工业化大批量生产。

附图说明

图1为邻联茴香胺染色后的3dpfalbino品系斑马鱼(虚线框内为红细胞分析区域)；

图2为地龙蛋白肽处理后斑马鱼血栓典型图；

图3为地龙蛋白肽处理后斑马鱼心脏红细胞染色典型图；

图4为地龙蛋白肽处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度(像素)与模型对照组比较，***p<0.001；

图5为地龙蛋白肽处理后斑马鱼预防血栓作用与模型对照组比较，***p<0.001；

图6为本发明使用柠檬酸制取活性地龙蛋白肽的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明提供了一种地龙蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：1)将地龙蛋白与柠檬酸水溶液混合后，0～20℃提取4～8h，获得提取料液；2)将所述提取料液进行固液分离，收集液相组分获得提取清液；3)将所述提取清液依次经过超滤、有机膜过滤获得滤液；4)将所述滤液经过液相色谱纯化、干燥获得地龙蛋白多肽。

本发明将地龙蛋白与柠檬酸水溶液混合后，0～20℃提取4～8h，获得提取料液。本发明对所述地龙蛋白的来源和规格没有特殊限定，采用市售的地龙蛋白或使用蚯蚓原料自行制备获得的地龙蛋白均可。在本发明中，所述地龙蛋白优选的经过抽样检验合格后使用。所述抽样检验包括铅、砷、汞、镉重金属检测。本发明中所述柠檬酸水溶液的浓度优选为0.45～0.55mol/l，更优选为0.48～0.52mol/l，最优选为0.5mol/l。本发明中，所述地龙蛋白与柠檬酸水溶液的质量比优选为1：(13～18)，更优选为1：(14～16)，最优选为1:15。本发明中，所述提取的温度优选为25℃；所述提取的时间优选为5～7h，更优选为6h。

本发明在获得所述提取料液后，将所述提取料液进行固液分离，收集液相组分获得提取清液。在本发明中，所述固液分离优选的采用离心的方式，所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为10000rpm，所述离心的时间优选为15～25min，更优选为20min；本发明中，所述提取清液中固含量优选为4～6％，更优选为5％；本发明中，所述固含量为利用阿贝折射仪进行浓度检测的检测结果，所述固含量在上述范围之内，为地龙蛋白肽的最佳出率。

本发明在获得提取清液后，将所述提取清液依次经过超滤、有机膜过滤获得滤液。在本发明中，所述超滤优选的采用陶瓷膜超滤，所述陶瓷膜的孔径优选为0.8～1.2μm，更优选为1μm。本发明中所述陶瓷膜超滤优选的采用超滤装置进行；本发明在所述超滤结束后，收集滤液获得小分子肽液，将所述收集到的小分子肽液用有机膜进行过滤；所述有机膜的截留分子量优选为10000d。本发明中所述超滤和有机膜过滤的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。

本发明在获得所述滤液后，将所述滤液经过液相色谱纯化、干燥获得地龙蛋白多肽。在本发明中，所述液相色谱纯化优选的采用制备型工业液相色谱，本发明对所述制备型工业液相色谱的具体程序和步骤如下：dac800大型工业化制备液相色谱分离装备通过动态轴向压缩柱洗脱的柱后溶液，经过检测器分析检测后分流到不同的储液罐实现收集。根据分离后组分流出的先后次序，或按时间、或按色谱峰的起止信号，根据控制软件预先设定好的程序，自动完成收集工作。用高流通量的专用流通池，以保证大流量的柱后溶液能够迅速被检测分离，保证回收的馏分纯度。

在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。所述冷冻干燥优选的采用冷冻干燥机进行，所述冷冻干燥包括冷冻阶段和升华阶段；所述冷冻阶段的温度优选为-45～-55℃，更优选为-48～-50℃，最优选为-49℃。所述升华阶段的时间优选为18～22h，更优选为20h；所述升华阶段升温的速度优选为3℃/小时；所述升华阶段最终的温度优选为20℃。

本发明还提供了所述制备方法制备获得的地龙蛋白肽。在本发明中，所述制备方法制备获得的地龙蛋白肽中富含纤溶蛋白溶解酶，与其他活性物质相结合后，使血栓中的纤溶蛋白溶解酶元转化成具有活性的纤溶蛋白溶解酶，从而溶解血栓中的纤维蛋白，也可直接溶解血栓，并且在溶解血栓的同时不会影响体内的凝血机制；纤溶蛋白溶解酶能溶解溶解血管壁上的纤维蛋白网状物，修复血管壁损伤，增强血管弹性，使血管扩张，软化血管；纤溶蛋白溶解酶在溶解血栓的同时，可使血液粘度降低，使血液流变学指标恢复正常，对心脑血管疾病有很好的防治效果。

本发明提供了所述制备方法制备获得的地龙蛋白肽在制备预防血栓药物中的应用。本发明中所述预防血栓药物中地龙蛋白肽的含量优选为10～90％；所述预防血栓药物优选的包括地龙蛋白肽可接受的其他活性成分和辅料；本发明对所述辅料的种类和含量没有特殊限定。

实施例1

用柠檬酸制取地龙蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料检测：将进厂的地龙蛋白进行抽样检验，合格的方可进行工业化生产。

(2)地龙蛋白进行调浆，使用0.5mol/l柠檬酸水溶液进行调浆，按照地龙蛋白：柠檬酸水溶液1：8的质量比例进行调浆。

(3)提取：按1:15总质量比添加余下的0.5mol/l柠檬酸水溶液，在温度20℃条件下提取6h。

(4)离心分离：将水解提取后的料液在离心机上进行分离，得到清料液(固含量5％)。

(5)膜过滤：将离心分离得到的清液通过超滤装置进行过滤，分离获得成小分子的肽液。

(6)有机膜过滤：小分子肽液再用10000d有机膜过滤，从而获得分子量10000d以上的肽类化合物；

(7)制备纯化：由制备型工业液相色谱仪设备进行分离纯化，dac800大型工业化制备液相色谱分离装备通过动态轴向压缩柱洗脱的柱后溶液，经过检测器分析检测后分流到不同的储液罐实现收集。根据分离后组分流出的先后次序，或按时间、或按色谱峰的起止信号，根据控制软件预先设定好的程序，自动完成收集工作。用高流通量的专用流通池，以保证大流量的柱后溶液能够迅速被检测分离，保证回收的馏分纯度。使产品的纯度达到50％。

(8)冷冻干燥：用冷冻干燥机，冷冻到-49℃，逐步升华至20℃的条件下，冷冻干燥，得到地龙蛋白肽。

实施例2

用柠檬酸制取地龙蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料检测：将进厂的地龙蛋白进行抽样检验，合格的方可进行工业化生产。

(2)地龙蛋白进行调浆，使用0.5mol/l柠檬酸水溶液进行调浆，按照地龙蛋白：柠檬酸水溶液1：8的质量比例进行调浆。

(3)提取：按1:17的总质量比添加余下的0.5mol/l柠檬酸水溶液，在温度30℃条件下提取5h。

(4)离心分离：将水解提取后的料液在离心机上进行分离，得到清料液(固含量约6％)。

(5)膜过滤：将离心分离得到的清液通过超滤装置进行过滤，分离成小分子的肽液。

(6)有机膜过滤：膜过滤的清液再用10000d有机膜过滤,从而更多的获得分子量10000d以上的肽类化合物；

(7)制备纯化：由制备型工业液相色谱仪设备进行分离纯化，dac800大型工业化制备液相色谱分离装备通过动态轴向压缩柱洗脱的柱后溶液，经过检测器分析检测后分流到不同的储液罐实现收集。根据分离后组分流出的先后次序，或按时间、或按色谱峰的起止信号，根据控制软件预先设定好的程序，自动完成收集工作。用高流通量的专用流通池，以保证大流量的柱后溶液能够迅速被检测分离，保证回收的馏分纯度。使产品的纯度达到50％。

(8)冷冻干燥：用冷冻干燥机，冷冻到-49℃，逐步升华至20℃的条件下，冷冻干燥，得到地龙蛋白肽。

实施例3

用柠檬酸制取地龙蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料检测：将进厂的地龙蛋白进行抽样检验，合格的方可进行工业化生产。

(2)地龙蛋白进行调浆，使用0.5mol/l柠檬酸水溶液进行调浆，按照地龙蛋白：柠檬酸水溶液1：8的质量比例进行调浆。

(3)提取：按1:15的总质量比添加余下的0.5mol/l柠檬酸水溶液，在温度20℃条件下提取6h。

(4)离心分离：将水解提取后的料液在离心机上进行分离，得到清料液(固含量约4％)。

(5)膜过滤：将离心分离得到的清液通过超滤装置进行过滤，分离成小分子的肽液。

(6)有机膜过滤：膜过滤的清液再用10000d有机膜过滤,从而更多的获得分子量10000d以上的肽类化合物；

(7)冷冻干燥：用冷冻干燥机，冷冻到-49℃，逐步升华至20℃的条件下，冷冻干燥，得到地龙蛋白肽。

实施例4

动物实验评价

1.实验材料

1#地龙蛋白肽由本发明实施例1制备获得、2#地龙蛋白肽由本发明实施例2制备获得、3#地龙蛋白肽由本发明实施例3制备获得，为黄色粉末。

黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼，黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后3天。

阿司匹林，批号为059k0199，购自上海晶纯实业有限公司。

花生四烯酸，淡黄色液体，购自上海晶纯实业有限公司。

低分子肝素钙注射液(速碧林)，购自葛兰素史克(中国)投资有限公司。

2.试验方法

随机选取270尾受精后3天(3dpf)黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，分别水溶给予，1#地龙蛋白肽450μg/ml、2#地龙蛋白肽450μg/ml和3#地龙蛋白肽450μg/ml浓度，阳性对照药阿司匹林25μg/ml和低分子肝素钙注射液c/200浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔中放入实验样品(实验组)1#地龙蛋白肽、2#地龙蛋白肽和3#地龙蛋白肽3ml。分别处理3h后，除正常对照组外，其余实验组均水溶给予花生四烯酸诱导斑马鱼建立血栓模型。

3.实验分析及数据处理

处理结束后，用邻联茴香胺进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，评价斑马鱼血栓形成，并用nis-elementsd3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼心脏红细胞染色强度(s)，并进行分析统计，根据统计学意义分别评价1#地龙蛋白肽、2#地龙蛋白肽和3#地龙蛋白肽对斑马鱼血栓形成的预防作用。统计学处理结果用mean±se表示1#地龙蛋白肽、2#地龙蛋白肽和3#地龙蛋白肽对斑马鱼血栓形成预防作用计算公式如下：

用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

表1地龙蛋白肽处理后斑马鱼预防血栓作用结果(n＝10)

与模型对照组比较，***p<0.001

模型对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度(693像素)与正常对照组(1641像素)比较p<0.001，表明模型建立成功。阳性对照药阿司匹林25μg/ml浓度组和低分子肝素钙注射液c/200浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为1247和1410像素，与模型对照组比较p均<0.001，对斑马鱼血栓形成的预防作用分别为58％和76％，说明阿司匹林和低分子肝素钙注射液均具有明显的预防血栓作用。

表1结果表示1#地龙蛋白肽450μg/ml浓度组与2#地龙蛋白肽450μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为1486像素和1431像素，预防血栓作用分别为84％和78％，两组与模型对照组比较p<0.001，1#地龙蛋白肽在450μg/ml浓度、2#地龙蛋白肽在450μg/ml和3#地龙蛋白肽450g/ml浓度条件下对花生四烯酸诱发的斑马鱼血栓形成均有明显的预防作用。详见表1、图1～图5，图1位为邻联茴香胺染色后的3dpfalbino品系斑马鱼(虚线框内为红细胞分析区域)；图2为地龙蛋白肽处理后斑马鱼血栓典型图；图3为地龙蛋白肽处理后斑马鱼心脏红细胞染色典型图；图4为地龙蛋白肽处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度(像素)与模型对照组比较，***p<0.001；图5为地龙蛋白肽处理后斑马鱼预防血栓作用与模型对照组比较，***p<0.001；可以看出本发明提供的地龙蛋白肽对斑马鱼血栓具有很好的预防效果。

由上述实施例可知，本发明提供的制备方法制备获得的地龙蛋白肽具有显著的预防血栓的作用，预防血栓的效果优于阳性对照药阿司匹林25μg/ml浓度组和低分子肝素钙注射液c/200浓度组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。