一种RAA-LFD检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种RAA-LFD(重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流层析试纸条)检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用。

背景技术：

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科的鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起的一种高度传染性呼吸道疾病。该病毒核酸为双股DNA，主要存在于鸡的气管组织和其渗出物中。ILT主要感染成年鸡，而雏鸡对该病有一定的抵抗力，感染后不会有明显的临床症状。ILT具有发病急，传播快的特点，成年鸡感染ILTV后会出现呼吸急促，流鼻涕，咳嗽等症状。随着病情进一步发展，患病鸡咳嗽症状加剧，呼吸极度困难，甚至咳出带有血丝的脓性粘液，部分患病鸡因呼吸道堵塞而窒息死亡。ILT传播速度快，感染率高，感染后难以清除。虽然ILTV的致死率依据毒株毒力强弱以及鸡只个体免疫力差异从5％～70％不等，但是该病毒可以感染所有年龄的蛋、肉、种用家禽，严重降低鸡只的生产性能，是危害养禽业的主要传染病之一。

目前对于ILTV大都采用PCR-琼脂糖凝胶电泳法、实时荧光定量PCR、ELISA检测ILTV血清抗体水平、病毒分离和鉴定及环介导等温核酸扩增等方法。其中PCR方法需要特别的仪器，在凝胶琼脂糖电泳法中大都使用对身体有害的染料；实时荧光定量PCR法中仪器价格昂贵，操作复杂；病毒分离鉴定法准确性不高，周期长；而ELSA法检测抗体存在非特异性反应等问题。因此，目前急需要一种简单、快捷、特异，又不需要昂贵仪器且非专业人员可操作的ILTV检测方法。

技术实现要素：

针对现有ILTV检测方法存在的成本高、操作复杂、准确度低、周期长以及易产生非特异性反应等问题，本发明提供一种RAA-LFD检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种RAA-LFD检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述探针序列如SEQ ID No.11所示。所述引物和探针序列如下：

上游引物序列ILTV-3-F：

5'-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3'；

下游引物序列ILTV-3-R：

5'-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3'；

探针序列：

5'-TTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCTC-R-AGACGTTACTACAAG-3'。

相对于现有技术，本发明提供的引物和探针组合，针对鸡传染性喉气管炎病毒保守的TK基因序列，并结合重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Add Amplification，RAA)和侧向流试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)特点而设计得到，探针和下游引物的5′端分别标记荧光基团和生物素(Biotin)，当探针为单链时候，核酸内切酶不识别，在RAA扩增过程中，探针与由引物扩增得到的目的片段结合后，核酸内切酶开始工作，两种标记物同时螯合到双链的扩增产物上，形成双标记产物，从而提高特异性。由引物和探针组合得到的双标记产物通过LFD肉眼观察即可判定结果，使ILTV检测操作简单、周期短、灵敏度高，更加适合临床现场检测。

进一步地，所述下游引物标记有生物素；所述探针的5′端修饰有荧光基团，距离5′端31bp位置有一个碱基缺口，缺口用四氢呋喃残基修饰，距离该缺口处15个碱基3′端阻断修饰。此探针根据鸡传染性喉气管炎病毒保守的TK基因序列、引物及RAA需求设计，能够避免与引物之间产生二级结构和二聚体，保证扩展反应的顺利进行，且具有特异性，当探针为单链时，核酸内切酶不识别，只有探针和目的片段结合后，核酸内切酶开始工作，探针与引物形成具有双标记的扩增产物，便于LFD中包被的特定抗体试纸条检出。

进一步地，所述荧光基团为6-羧基荧光素(6-FAM)或异硫氰酸荧光素(FITC)。探针与引物共同作用，在RAA扩增过程中，荧光基团与生物素同时螯合到双链的扩增产物上，形成双标产物，便于被LFD(包被有特定抗体试纸条)检出，省去电泳操作，直接肉眼观察结果，快速方便。

本发明还提供了上述引物和探针组合在非诊断性检测鸡传染性喉气管炎病毒中的应用。

本发明还提供了包含上述引物和探针组合的检测鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒。

进一步地，上述检测鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒，还包括RT-RAA核酸扩增试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒以及侧流层析试纸条，更加快捷地检测鸡传染性喉气管炎病毒。

将上述引物和探针或包含该引物和探针的试剂盒用于检测鸡传染性喉气管炎病毒。

本发明还提供了利用上述引物和探针组合检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取鸡传染性喉气管炎病毒基因组DNA；

(2)以所述DNA为模板，利用所述引物和探针组合进行RAA扩增；

(3)采用LFD对RAA扩增产物进行检测。

进一步地，所述RAA扩增反应体系为：基础缓冲液25μL、上游引物和下游引物各2.1μL、探针0.6μL、DNA模板1μL、纯化水16.7μL以及乙酸镁2.5μL，DNA模板浓度为200-240ug/μL，引物和探针浓度为1200-1500nmol/L。

进一步地，所述RAA扩增反应温度为35-40℃，时间为15-20min。在该温度条件下即可快速完成反应，不需要热溶解或化学溶解，因此也不需要昂贵复杂的设备，操作简单，并有效缩短检测时间。

进一步地，步骤(3)中，LFD出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFD的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。采用层析式双抗体夹心法快速检测核酸扩增产物，扩增产物可以直接经LFD可视化检测，操作简单，判断迅速，不含有毒物质，不用复杂操作和昂贵仪器。

相对于现有技术，本发明提供的检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，将RAA和LFD结合，使特异性高且与其它类症禽病病原体核酸无交叉反应的引物和探针组合，通过RAA扩增过程，快速形成双标记产物，并通过LFD肉眼观察即可判定结果。RAA-LFD检测方法简单、快捷、方便、特异性强且灵敏度高，更加适合临床现场检测。

附图说明

图1是本发明实施例RAA引物筛选结果图；

图2是本发明实施例RAA-LFD方法特异性检测结果图；

图3是普通PCR检测方法敏感性测试结果图；

图4是荧光定量PCR敏感性测试结果图；

图5是本发明实施例RAA-LFD方法敏感性测试结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

RAA-LFD检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针设计

对比ILTV的TK基因序列，并结合RT-RAA核酸扩增试剂盒要求设计4对引物(如表1所示)。采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取ILTV王岗株的基因组DNA，并将其作为模板。使用RT-RAA核酸扩增试剂盒进行扩增，反应体系：荧光基础缓冲液(试剂盒自带)25μL、上下游引物各(10μM)2.1μL、模板(220ug/μL)1μL、纯化水17.3μL和乙酸镁2.5μL。39℃反应20min，反应结束后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测RAA反应产物(如图1所示，M为DL2000Marker，从左到右依次为阴性对照，引物ILTV-1、ILTV-2、ILTV-3及ILTV4的扩增产物)，结果表明4对引物均能扩增出单一目的条带，但ILTV-3-F/ILTV-3-R的特异性和扩增效率最好，其余三对引物对其他相似病毒也能进行扩增。因此选取引物ILTV-3-F/ILTV-3-R作为上游引物(SEQ ID No.1)和下游引物(SEQ ID No.2)。将所选的下游引物ILTV-3-R标记生物素(Biotin)。

表1

为了避免二聚体和发卡结构的形成，将所选的引物对比基因序列，并结合试剂盒要求设计探针，并对探针进行荧光标记。探针序列如SEQ ID No.11所示。在探针5′端修饰荧光基团FAM，距离5′端31bp位置有一个碱基缺口，缺口用四氢呋喃(THF)残基修饰，3′端C3-spacer阻断修饰。

其中，ILTV标准强毒王岗株(AV195)购自中国兽医药品监察所，RT-RAA核酸扩增试剂盒购自江苏奇天生物科技有限公司，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，胶体金侧流层析试纸条购自杭州优思达生物科技公司(试纸条设有FAM抗体检测线和生物素抗体质控线)，引物和探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成、标记。

将上述设计得到的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示引物和SEQ ID No.11所示探针用于检测鸡传染性喉气管炎病毒或用于制备检测鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒。检测鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒，包括SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物、SEQ ID No.11所示探针、RT-RAA核酸扩增试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒以及侧流层析试纸条。

实施例2

利用上述引物和探针组合检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取ILTV标准强毒王岗株(AV195)基因组DNA；

(2)以上述所得DNA为模板，利用RT-RAA核酸扩增试剂盒与SEQ ID No.1所示上游引物、SEQ ID No.2所示下游引物和SEQ ID No.11所示探针进行RAA扩增，RAA扩增反应体系为：荧光基础缓冲液25μL、上游引物和下游引物各2.1μL、探针0.6μL、DNA模板1μL、纯化水16.7μL以及乙酸镁2.5μL，DNA模板浓度为220ug/μL，引物和探针浓度为1250nmol/L，于37℃，反应20min，得到RAA扩增产物；

(3)采用LFD对RAA扩增产物进行检测，取10μL的RAA扩增产物滴加到检测区，试纸条插入加有100μL缓冲液的2ml离心管内，3min后观察结果。LFD出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFD的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。

实施例3

利用上述引物和探针组合检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取ILTV标准强毒王岗株(AV195)基因组DNA；

(2)以上述所得DNA为模板，利用RT-RAA核酸扩增试剂盒与SEQ ID No.1所示上游引物、SEQ ID No.2所示下游引物和SEQ ID No.11所示探针进行RAA扩增，RAA扩增反应体系为：荧光基础缓冲液25μL、上游引物和下游引物各2.1μL、探针0.6μL、DNA模板1μL、纯化水16.7μL以及乙酸镁2.5μL，DNA模板浓度为200ug/μL，引物和探针浓度为1200nmol/L，于35℃，反应18min，得到RAA扩增产物；

(3)采用LFD对RAA扩增产物进行检测，取10μL的RAA扩增产物滴加到检测区，试纸条插入加有100μL缓冲液的2ml离心管内，3min后观察结果。LFD出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFD的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。

实施例4

利用上述引物和探针组合检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取ILTV标准强毒王岗株(AV195)基因组DNA；

(2)以上述所得DNA为模板，利用RT-RAA核酸扩增试剂盒与SEQ ID No.1所示上游引物、SEQ ID No.2所示下游引物和SEQ ID No.11所示探针进行RAA扩增，RAA扩增反应体系为：荧光基础缓冲液25μL、上游引物和下游引物各2.1μL、探针0.6μL、DNA模板1μL、纯化水16.7μL以及乙酸镁2.5μL，DNA模板浓度为240ug/μL，引物和探针浓度为1500nmol/L，于40℃，反应15min，得到RAA扩增产物；

(3)采用LFD对RAA扩增产物进行检测，取10μL的RAA扩增产物滴加到检测区，试纸条插入加有100μL缓冲液的2ml离心管内，3min后观察结果。LFD出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFD的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。

为了更好的说明本发明实施例提供的检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法(RAA-LFD方法)的特性，下面对其特异性、灵敏性进行验证。

特异性实验：

利用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取禽流感(Avian influenza virus，AIV)、传染性支气管炎(Infectious bronchitis virus,IBV)、鸡新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)基因组，反转录得相应的cDNA。其中，IBV、NDV、AIV均为本实验室临床检测后保存。

以ILTV的DNA，IBV、NBV、AIV的cDNA为模板，按照实施例2中方法，经RT-RAA核酸扩增试剂盒反应体系扩增后，经过LFD检测只有ILTV的RAA扩增产物在试纸条上同时出现检测线和质控线，而其它病毒和阴性对照(已纯化水替代DNA模板)的产物只能出现质控线，结果如图2所示。由此说明本发明实施例提供的方法特异性较好，且RAA-LFD方法成立。

灵敏性实验：

重组质粒标准品的制备

提取的ILTV基因组DNA为模板DNA，引物为ILTV-3-F/ILTV-3-R，按照普通PCR要求修改引物长度，(序列为F：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCAT-3′(SEQ ID No.9)，R：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAAC-3′(SEQ ID No.10))，50μL反应体系：2×Taq Mix 25μL、DNA模板(220ug/μL)2μL、上下游引物(10μM)各1μL及21μL的dd H2O补足。反应程序为：94℃，5min；94℃变性45s；56℃退火45s；72℃延伸60s，35个循环扩增；72℃延伸10min，4℃保存。将纯化后的目的片段连接到pMD20质粒，纯化筛选后选取标准质粒，并且根据摩尔定律计算单位体积质粒所含DNA拷贝数。

质粒拷贝数(拷贝/L)＝[质粒浓度(g.μL^-1)×6.02×10²³]/[总片段长度(bp)×660g/mol]；

总片段长＝载体长度(bp)+片段长度(bp)。

将构建的标准质粒稀释为10⁰～10⁸拷贝/μL梯度浓度，比较RAA-LFD方法，普通PCR方法和荧光定量PCR方法的敏感性。

RAA-LFD反应体系和条件与实施例2中相同。

普通PCR为25μL体系：2×Gflex PCR Buffer(Mg²⁺，dNTP plus)12.5μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，TksGflex DNA Polymerase(1.25units/μL)0.5μL，模板(220ug/μL)1μL，其余用水补齐。反应程序按照：94℃，1min；98℃，10s；55℃，15s；68℃，30s；30个循环后，68℃延伸5min。

荧光定量PCR为25μL体系(引物同普通PCR)：TB Green Premix DimerEraser(2X)12μL，上下游引物(10μM)各0.75μL，模板(220ug/μL)2μL，其余用水补齐。反应程序为：95℃，30s；95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s；40个循环。

灵敏性试验结果表明普通PCR最低检出线为10⁴拷贝/μL(如图3所示，从左到右依次为marker，1-8为10⁷拷贝/μL-10⁰拷贝/μL，9为阴性对照)，荧光PCR为10¹拷贝/μL(如图4所示，0为阴性对照，1-7依次为10⁰拷贝/μL-10⁶拷贝/μL)，RAA-LFD检测限为10²拷贝/μL(如图5所示，从左到右依次为阴性，1-6依次为模板浓度10⁰～10⁵拷贝/μL)。RAA-LFD检测方法敏感性低于荧光PCR定量，却明显高于普通PCR，为普通PCR灵敏度的100倍。

为了更好的说明本发明实施例提供的RAA-LFD方法的特性，下面将RAA-LFD方法与PCR方法分别进行临床样品检测。利用RAA-LFD方法检测临床疑似病料45份，阳性结果35份，阴性结果为10份；用普通PCR方法检测阳性结果32份，阴性结果13份。RAA-LFD检测方法准确率比普通PCR高。两种方法的符合率为94％。证明本发明提供的RAA-LFD方法准确度高、特异性好，适合用于ILTV的现场检测。

由以上数据可知，本发明提供的引物和探针组合，特异性好，与其它类症禽病病原体核酸无交叉反应，能够用于检测鸡传染性喉气管炎病毒。同时，本发明提供的RAA-LFD方法简单、快捷、方便、可靠、特异性强、灵敏度高且准确率高，更加适合临床现场检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种RAA-LFD检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用

<130> 20190730

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ctcatcacta tcctcctcaa cctcctcctc 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

actgattgta tggcacgaga tgaagaaact 30

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