[0001]
本发明属于色谱纯化分离重组胰岛素或胰岛素类似物的制备领域。具体涉及一种高效液相色谱技术纯化制备胰岛素的方法。
背景技术：[0002]
糖尿病为一种慢性代谢性疾病，有多饮、多食、多尿以及体重降低的临床症状，尤其是会引起心脑血管以及神经系统等并发症，患者生命健康受到严重威胁。近年来，全世界糖尿病的发病率正在呈现“爆炸式”增长，患病率达到10％以上。现糖尿病治疗药物种类很多，胰岛素仍是糖尿病治疗效果最佳的首选降糖药物。中国是全球糖尿病第一大国，胰岛素市场前景也将十分广阔，且需求量呈明显上升趋势。
[0003]
胰岛素(insulin)是一种能够降低体内血糖最有效的蛋白激素类药物，是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等刺激而分泌的一种蛋白质激素。1型糖尿病患者和2型糖尿病患者都需注射胰岛素来控制血糖从而提高生活质量以及降低糖尿病并发症的发生。随着胰岛素技术的不断发展，人们通过基因工程手段又相继开发出了诸如赖谷胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、德谷胰岛素等新一代胰岛素类似物；但全球每年要消耗胰岛素5000kg左右，产量缺口巨大。胰岛素纯化分离过程中有胰岛素原和性质非常相似的脱酰胺胰岛素等杂质，注射到机体后会引起一定的副作用，所以胰岛素的极高纯度要求显得尤为严格。且目前国内许多生物医药公司都在开展糖尿病药物胰岛素及其类似物的临床申报工作，以致企业之间的竞争态势会日趋激烈，研发低成本大规模制备胰岛素的方法是亟待解决的问题，故胰岛素的高效纯化工艺开发具有重要的意义。
[0004]
为了达到胰岛素制剂所需要的纯度，目前大多数联合2-3步离子交换和高效液相制备色谱技术来对胰岛素进行纯化分离。离子交换色谱技术主要去除与胰岛素性质相差较大的杂质，而高效液相色谱作为精制工序可以显著提高胰岛素的纯度，这样整体纯化工序多，造成总收率会偏低。虽然高效液相色谱分辨率高，分离的产品可以达到较高的纯度，但高效反相色谱工艺方法具有一些的缺点；如载样量不高、收率低、溶剂消耗和馏分收集体积大等。因此，建立一种高效、成本低、溶剂消耗量小、产品纯度及收率高且适合工业化纯化制备胰岛素及其类似物的色谱纯化方法具有重要的价值和应用前景。
[0005]
本发明通过对胰岛素的液相色谱纯化分离的条件进行方法学优化及峰展宽摸索获得最佳的纯化制备工艺参数，进一步放大到工业制备级液相色谱分离上，得到高纯度的胰岛素。本发明的方法学适用于分析色谱、半制备色谱、特别是制备色谱，可以理解为工业规模上制备纯的产品。
技术实现要素：[0006]
本发明的目的在于提供一种胰岛素及其类似物的纯化制备方法，具体而言，本发明设计一种采用工业制备级液相色谱技术高效纯化制备高纯度胰岛素的新方法，目的在于
解决目前在胰岛素粗品精制过程中所存在的收率低、成本较高及纯度不佳的问题。
[0007]
为了实现上述发明目的，本发明采用的纯化制备胰岛素及其类似物的方法如下：
[0008]
(1)样品预处理：将胰岛素样品用缓冲盐水溶液或有机溶剂与缓冲盐水溶液的混合溶液溶解，完全溶解后过滤；
[0009]
(2)工艺条件的优化：采用非线性色谱方法学进行胰岛素的高效反相色谱法纯化条件的优化，具体为：对(1)中胰岛素样品进行高效液相制备色谱条件摸索及峰展宽的比较，筛选出色谱柱填料、载样量、流动相包括缓冲盐水溶液种类及浓度、ph值、有机相、流动相梯度、流速的工艺参数范围，得出优化的工艺条件；
[0010]
(3)纯化制备：采用(2)中优化的工艺条件对(1)中预处理后的胰岛素样品的进行纯化分离制备，收集色谱峰馏分，对馏分进行相关蛋白与高分子蛋白分析检测，合并合格馏分；
[0011]
(4)馏分后处理：对(3)得到的合格馏分进行后处理，即得到高纯度的胰岛素产品。
[0012]
本发明的胰岛素样品的色谱纯度在35-98％之间。
[0013]
本发明步骤1)中胰岛素样品的状态可以是固体粉末或液体；胰岛素蛋白的浓度为0.1-100mg/ml；胰岛素的种类可以是人胰岛素、动物胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素或者它们类似物。
[0014]
本发明步骤2)中优化的工艺参数中有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或者异丙醇；所述缓冲盐水溶液为na
+
、k
+
、li
+
、h
+
、et3nh
+
、nh
4+
之一种或两种以上为阳离子，po
43-、hpo
42-、h2po
43-、ch3coo-、hcoo-、cl-、clo
4-、hco
3-、so
32-之一种或两种以上为阴离子的盐溶液；所述缓冲盐水溶液浓度为1-1000mm，缓冲盐水溶液ph值为2.0-11.0。
[0015]
本发明步骤2)中高效反相色谱柱的填料基质可以为硅胶或高分子聚合物；填料配基的碳原子数为4-30的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为5-100μm，孔径为比表面积为100～500m2/g；色谱柱内径为4.6-1600mm，柱床高度为50-1000mm。
[0016]
本发明步骤2)中胰岛素色谱纯化的优化条件包括色谱柱的载样量为固定相重量的0.01-30％；色谱柱的上样和洗脱流速为20-350cm/h；起始有机溶剂的含量为5-40％；梯度洗脱为流动相中有机相与缓冲盐水溶液的体积比(v/v)范围由5:95-80:20在20-200min内变为40:60-95:5，所述洗脱的方式为等度洗脱和梯度洗脱，或是两种方式联合的洗脱方案。
[0017]
本发明步骤3)中根据非线性色谱方法学优化得到的胰岛素反相色谱纯化分离工艺参数包括流动相中有机相种类优选乙腈及乙醇，浓度优选为45-55％，缓冲盐水溶液种类优选乙酸铵和磷酸二氢钠体系，浓度优选50-75mm，ph值优选为4.5-10.0(不同种类胰岛素最合适的ph不同，如人胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、猪胰岛素优选ph 4.5或6.5、门冬胰岛素优选ph 5.9-6.0、甘精胰岛素优选ph 5.2或10.0、地特胰岛素、德谷胰岛素优选ph 3.5-4.0等)。
[0018]
本发明步骤3)中胰岛素色谱纯化优化工艺参数包括填料基质优选硅胶，配基优选为c8和c4，填料粒径优选7-15μm，孔径为线性流速优选为50-100cm/h。
[0019]
本发明步骤3)中胰岛素纯化制备的温度条件为4-50℃；检测波长为210nm-280nm；馏分接取的方式可以由紫外峰或体积指导收集。
[0020]
本发明步骤4)中后处理方式为溶液中加入浓度为10-30％的醋酸锌溶液(v/v)调
节ph值或低温浓缩沉淀，通过离心和冻干方式得到胰岛素纯品粉末。
[0021]
本发明所述胰岛素及其类似物的分离及制备方法：胰岛素粗品溶液采用单针上柱吸附、解析并进行分段收集；或采用多针分批连续方式上柱、解析的连续进样纯化方式，且对每批解析液进行分段收集。
[0022]
本发明具有如下优点：
[0023]
本发明可以一步将胰岛素样品或其类似物从初始纯度40-90％提高到纯度为95％以上。
[0024]
(1)高选择性：为解决当前胰岛素纯化制备遇到的问题，本发明提出使用纯化方法学优化的制备工艺参数条件下胰岛素在色谱柱上得到较好分离，有效解决了选择性不足的问题。
[0025]
(2)高效性：收率高、周期时间短、后处理简单、成本低。
[0026]
(3)载样量大：易于实现工业化生产。
[0027]
(4)高重复性：实验操作简单可控，工艺条件稳定，重复性好。
[0028]
(5)环境友好：有机溶剂使用量少。
附图说明
[0029]
图1是人胰岛素样品高分子蛋白杂质高效液相分析图。
[0030]
图2是人胰岛素样品相关蛋白杂质高效液相分析图。
[0031]
图3是实施例1中优化的工艺参数条件下人胰岛素纯化分离的模拟制备谱图。
[0032]
图4是实施例1中优化的工艺参数条件下人胰岛素纯化分离的小规模放大制备谱图。
[0033]
图5是实施例1中纯化馏分的高分子蛋白杂质高效液相分析图。
[0034]
图6是实施例1中纯化馏分的相关蛋白杂质高效液相分析图。
具体实施方式
[0035]
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0036]
实施例1
[0037]
称取500mg人胰岛素样品溶于ph 4.0流动相a所对应的有机盐或有机盐与有机溶剂的混合缓冲液中(浓度15mg/ml)，加乙酸调节ph至3.5使胰岛素固体完全溶解至透明，使用0.45μm滤膜过滤。采用高效液相分析方法对原液进行高分子及相关蛋白杂质分析；分析结果见图1和2。流动相a为90％250mm甲酸铵/水+10％乙腈，ph 4.0，流动相b为10％250mm甲酸铵/水+90％乙腈，ph 4.0。
[0038]
采用流动相a平衡模拟制备色谱柱(c8，10μm，10*250mm，80cm/h流速)2-3bv，将胰岛素原液泵或样品环通过高效液相系统上样至平衡好的反相色谱柱，上样量300mg，梯度为0-10min从30-35％b相，10-90min从35-60％b相，90-100min从60-95％b相。采用的紫外光度检测器的检测波长为280nm；模拟制备谱图见图3，收集目标峰馏分合并洗脱馏分进行hplc分析。
[0039]
采用高效液相制备色谱系统，按照模拟制备的方法条件小规模放大进行人胰岛素
样品的高效液相制备色谱纯化。具体过程如下，将c8反相色谱柱(填料重量300g装填于dac50高压色谱柱管中，流速80cm/h)连接到高压液相制备系统上，采用流动相a冲洗平衡色谱柱2-3bv，通过泵将胰岛素原液上样至平衡好的色谱填料中，梯度条件及检测波长和模拟制备一致，制备谱图如图4所示。收集目标峰馏分进行hplc分析，馏分中高分子杂质及相关蛋白杂质含量检测结果见图5和图6；结果显示，经高效液相纯化制备后，胰岛素的纯度显著提高，收率约95％以上。
[0040]
对合格馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的胰岛素纯品粉末。
[0041]
实施例2
[0042]
称取1g甘精胰岛素样品溶于ph 5.5流动相a所对应的有机盐或有机盐与有机溶剂的混合缓冲液中(浓度20mg/ml)，加乙酸调节ph至3.5使胰岛素固体完全溶解至透明，使用0.45μm滤膜过滤。采用高效液相分析方法对原液进行高分子及相关蛋白杂质分析。流动相a为90％100mm乙酸铵/水+10％乙腈，ph 5.5，流动相b为10％100mm乙酸铵/水+90％乙腈，ph 5.5。
[0043]
采用流动相a平衡模拟制备色谱柱(c8，9μm，10*250mm，100cm/h流速)2-3bv，将胰岛素原液泵或样品环通过高效液相系统上样至平衡好的反相色谱柱，上样量300mg，梯度为0-8min从30-36％b相，8-68min从36-56％b相，68-75min从56-95％b相。采用的紫外光度检测器的检测波长为280nm；收集目标峰馏分合并洗脱馏分进行hplc分析。
[0044]
采用高效液相制备色谱系统，按照模拟制备的方法条件小规模放大进行甘精胰岛素样品的高效液相制备色谱纯化。具体过程如下，将c8反相色谱柱(填料重量300g装填于dac50高压色谱柱管中，流速100cm/h)连接到高压液相制备系统上，采用流动相a冲洗平衡色谱柱2-3bv，通过泵将胰岛素原液上样至平衡好的色谱填料中，梯度条件及检测波长和模拟制备一致。收集目标峰馏分进行hplc分析高分子杂质及相关蛋白杂质含量；结果显示，经高效液相纯化制备后，胰岛素的纯度显著提高，收率约95％以上。
[0045]
对合格馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的胰岛素纯品粉末。
[0046]
实施例3
[0047]
称取800mg门冬胰岛素样品溶于ph 5.0流动相a所对应的有机盐或有机盐与有机溶剂的混合缓冲液中(浓度20mg/ml)，加乙酸调节ph至3.5使胰岛素固体完全溶解至透明，使用0.45μm滤膜过滤。采用高效液相分析方法对原液进行高分子及相关蛋白杂质分析。流动相a为90％75mm乙酸铵/水+10％乙腈，ph 5.0，流动相b为10％75mm乙酸铵/水+90％乙腈，ph 5.0。
[0048]
采用流动相a平衡模拟制备色谱柱(c8，10μm，10*250mm，70cm/h流速)2-3bv，将胰岛素原液泵或样品环通过高效液相系统上样至平衡好的反相色谱柱，上样量300mg，梯度为0-10min从30-35％b相，10-90min从35-55％b相，90-100min从55-95％b相。采用的紫外光度检测器的检测波长为280nm；收集目标峰馏分合并洗脱馏分进行hplc分析。
[0049]
采用高效液相制备色谱系统，按照模拟制备的方法条件小规模放大进行门冬胰岛素样品的高效液相制备色谱纯化。具体过程如下，将c8反相色谱柱(填料重量300g装填于dac50高压色谱柱管中，流速70cm/h)连接到高压液相制备系统上，采用流动相a冲洗平衡色谱柱2-3bv，通过泵将胰岛素原液上样至平衡好的色谱填料中，梯度条件及检测波长和模拟制备一致。收集目标峰馏分进行hplc分析高分子杂质及相关蛋白杂质含量；结果显示，经高
效液相纯化制备后，胰岛素的纯度显著提高，收率约95％以上。
[0050]
对合格馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的胰岛素纯品粉末。
[0051]
实施例4
[0052]
称取500mg人胰岛素样品溶于ph 4.5流动相a所对应的有机盐或有机盐与有机溶剂的混合缓冲液中(浓度20mg/ml)，加乙酸调节ph至3.5使胰岛素固体完全溶解至透明，使用0.45μm滤膜过滤。采用高效液相分析方法对原液进行高分子及相关蛋白杂质分析。流动相a为90％50mm磷酸二氢钠/水+10％乙腈，ph 4.5，流动相b为10％50mm磷酸二氢钠/水+90％乙腈，ph 4.5。
[0053]
采用流动相a平衡模拟制备色谱柱(c18，9μm，10*250mm，100cm/h流速)2-3bv，将胰岛素原液泵或样品环通过高效液相系统上样至平衡好的反相色谱柱，上样量300mg，梯度为0-5min从25-35％b相，5-65min从35-60％b相，65-75min从60-95％b相。采用的紫外光度检测器的检测波长为280nm；收集目标峰馏分合并洗脱馏分进行hplc分析。
[0054]
采用高效液相制备色谱系统，按照模拟制备的方法条件小规模放大进行人胰岛素样品的高效液相制备色谱纯化。具体过程如下，将c18反相色谱柱(填料重量300g装填于dac50高压色谱柱管中，流速100cm/h)连接到高压液相制备系统上，采用流动相a冲洗平衡色谱柱2-3bv，通过泵将胰岛素原液上样至平衡好的色谱填料中，梯度条件及检测波长和模拟制备一致。收集目标峰馏分进行hplc分析高分子杂质及相关蛋白杂质含量；结果显示，经高效液相纯化制备后，胰岛素的纯度显著提高，收率约95％以上。
[0055]
对合格馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的胰岛素纯品粉末。
[0056]
此实验方法可用于各种类别胰岛素及其类似物纯化工艺的开发，均可获得高纯度、高收率的胰岛素精制物，该方法可以降低生产成本，使得工艺操作更加简单。
[0057]
上述各实施例中，相关蛋白hplc分析条件如下：
[0058]
(1)色谱柱填料：unitary c18(5μm，4.6*250mm)；
[0059]
(2)磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠20.7g，加800ml水溶解，85％磷酸调节ph至2.5，然后加水至1000ml。流动相a：磷酸缓冲盐250ml+乙腈250ml+水400ml+氯化钠18.4g加水定容至1l，流动相b：磷酸缓冲盐250ml+乙腈650ml+水50ml+氯化钠3.2g加水定容至1l；
[0060]
(3)流速：1ml/min；
[0061]
(4)梯度条件：0-20min从4-17％b相，20-30min从17-37％b相，30-40min从37-4％b相；
[0062]
(5)柱温：35℃；
[0063]
(6)检测波长：214nm；
[0064]
(7)进样体积：2μl。
[0065]
上述各实施例中，高分子蛋白hplc分析条件如下：
[0066]
(1)色谱柱填料：tskgel g2000 pwxl(7μm，7.8*300mm)；
[0067]
(2)流动相：冰醋酸-乙腈-0.1％精氨酸溶液(15：20：65)；
[0068]
(3)流速：0.5ml/min；
[0069]
(4)梯度条件：流动相等度洗脱30min；
[0070]
(5)柱温：35℃；
[0071]
(6)检测波长：276nm；
[0072]
(7)进样体积：4μl。
[0073]
如图1-6所示，hplc分析结果表明，纯化前后样品中杂质含量显著降低，根据总体积、积分峰面积计算纯化后胰岛素纯度可达99％以上，收率达95％以上。上述实验结果表明了，采用本发明中胰岛素的纯化方法学优化的制备工艺具有高纯度、高收率、溶剂使用量及馏分收集体积低及减少后处理负担等优势。
[0074]
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。