抗BCoV-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体和应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一株抗bcov-n蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及其抗体和应用。

背景技术：

牛冠状病毒(bovinecoronavirus，bcov)属于套式病毒目(nidovirales)，冠状毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)，是一个多形的、有囊膜、单股正链的rna病毒。bcov是引起牛呼吸道感染、新生犊牛腹泻和成年牛冬痢的重要病源，从1972年起，bcov已被多个国家有所报道，该病呈世界性分布，不仅影响奶牛产奶性能而且病愈后的犊牛生长、发育和生产性能都会受到影响，bcov主要由消化道和呼吸道两种途径传播，感染的牛会在特定的时间排毒来感染牛群，目前国内尚无有效的疫苗，因此，早期诊断对于防控该病具有重要意义。

bcov粒子共有5种主要结构蛋白：核衣壳蛋白n，囊膜蛋白m，纤突蛋白s，小膜蛋白e和血凝脂酶糖蛋白he，含有3个结构域的核衣壳蛋白(n)是一种碱性磷蛋白，在冠状病毒rna合成中发挥作用，经dnastar软件预测的n蛋白免疫原性较好的疏水区域，同时具有高度的保守性，获得的重组蛋白为可溶性表达，采用镍柱天然条件下纯化得到的有活性蛋白，亲和力较好，容易与抗体结合。但是，用大肠杆菌表达重组蛋白制备单克隆抗体最大的弊端就是容易出现抗原构象改变，导致制备的单克隆抗体不能识别病毒粒子。

杂交瘤技术自20世纪70年代问世以来，到今日已经是很成熟的技术。从抗原的制备到杂交瘤细胞的冻存在能保证实验顺利进行的前提下试验周期约为5个月。实验周期较长，是一门综合性实验技术，涉及到小鼠免疫，细胞培养等步骤，受多种试验因素影响。综上，将杂交瘤技术应用于生产抗bcov-n蛋白单克隆抗体还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种抗bcov-n蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系，其菌种保藏编号为cgmccno:17693。

本发明的第二目的是提供上述抗bcov-n蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明的第三目的是提供上述单克隆抗体的制备方法。

本发明的第四目的是提供上述单克隆抗体的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株抗bcov-n蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与sp2/0细胞经过细胞融合产生，其菌种保藏编号为cgmccno.17693。

二、上述的抗bcov-n蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

三、上述单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建好的pet-32a-bcov-n重组菌诱导表达产生pet-32a-bcov-n蛋白；

(2)pet-32a-bcov-n蛋白为可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠；

(3)获取免疫小鼠的脾细胞，和sp2/0细胞融合产生杂交瘤细胞；

(4)杂交瘤细胞注入小鼠，产生抗bcov-n蛋白单克隆抗体。

四、上述单克隆抗体在抗牛冠状病毒中的应用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明利用dnastar软件预测了bcov-cd株的n蛋白主要抗原表位，通过原核表达技术制备了含有该表位的重组bcov-n蛋白，而且能够可溶性表达，通过镍柱纯化获得了具有天然活性的bcov-n蛋白，本发明进一步制备了抗bcov-n蛋白为单克隆抗体，本发明制备的5株单克隆抗体在westernblot和ifa实验中均能与bcov发生特异性反应，说明该单克隆抗体与活性bcov病毒粒子具有较好的亲和性，而且特异性实验结果表明这5株单克隆抗体与brv、bvdv、ibrv和bpiv3等牛源常见病毒没有交叉反应，更进一步证明这些抗体在制备bcov抗原诊断试剂盒和基础研究方面具有重要商业价值。

附图说明

图1是本发明pet-32a-bcov-n蛋白纯化结果；

图2是本发明阳性杂交瘤细胞株筛选结果；

图3是本发明重组bcovn蛋白纯化结果；

图4是本发明westernblot鉴定结果；

图5是本发明腹水单克隆抗体ifa鉴定结果；

图6是本发明单克隆抗体特异性鉴定ifa结果；

图7是本发明单克隆抗体的染色体数量鉴定(1000×)。

本发明所涉及的杂交瘤细胞2f9，于2019年5月27日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.17693。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、牛冠状病毒(bovinecoronavirus，bcov)cd株：牛冠状病毒s基因的序列分析及原核表达，高国强，王梦心，刘明明等，中国畜牧兽医，2018年45卷第7期，1740-1749页。

2、牛轮状病毒(bovinerotavirus，brv)dq株：新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定，谢金鑫，侯喜林，董华兴等，黑龙江八一农垦大学学报，2010年22卷第5期，56-59页。

3、牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirus，bpiv3)hj-1株：牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究，周玉龙，吴海涛，任亚超等，中国人兽共患病学报，2011年27卷第1期，23-28页。

4、牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，bvdv)hj-1株：牛病毒性腹泻病毒黑龙江分离株的分离鉴定，张国华，吴丹丹，周玉龙等，中国预防兽医学报，2015年37卷第10期，805-807页。

5、ibrvdq株：ibrvdq分离株gi基因的克隆与序列分析，王延涛，周玉龙，李国军，侯喜林，朴范泽，动物医学进展，2007年第9期，23-25页。

6、bcovdq株：牛冠状病毒的分离鉴定，关新，朴范泽，侯喜林，黑龙江八一农垦大学学报，2007年第2期，55-58页。

7、s/p20细胞、mdbk(牛肾细胞)、vero(非洲绿猴肾细胞)和hrt-18(人直肠癌细胞)购自中国科学院上海细胞库；

8、bcovn蛋白重组大肠杆菌(pet-32a-n)：一种牛冠状病毒elisa检测试剂盒，专利号：201810424384.8，申请日：2018年5月7日，公开号：cn108318686a，公开日：2018年7月24日。

实施例1

实施例1说明重组bcovn蛋白的纯化及浓度测定：

将构建好的pet-32a-bcov-n重组菌进行诱导表达，12000r/min离心5min，收集细菌，菌液超声破碎，分离上清液，利用ni-ntahis-bind树脂纯化n蛋白，按照bca试剂盒说明书的方法对纯化后的pet-32a-bcov-n蛋白进行浓度测定。

按照ni-ntahis-bind树脂自然条件下纯化pet-32a-bcov-n蛋白，采用不同浓度的咪唑洗脱缓冲液来洗脱靶蛋白，经sds-page凝胶分析，当咪唑浓度为20mm时洗脱效率最大，第2-4遍洗脱时回收效率最高，见图1，m：低相对分子质量蛋白marker；1：菌液上清；2-9：20mm咪唑洗脱次数从1～9遍。

实施例2

实施例2说明balb/c鼠免疫：

以纯化的重组pet-32a-bcov-n蛋白为抗原，应用足垫免疫法对6～8周龄雌性balb/c小鼠进行免疫，过程如下：将pet-32a-bcov-n蛋白浓度调节至200μg/ml，与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，取100μl乳化物进行足垫免疫，两后足垫分别免疫50μl，一周以后，对小鼠进行二免，取200μg/ml的pet-32a-bcov-n蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合乳化，取100μl乳化物对小鼠进行足垫免疫，两后足垫分别免疫50μl，三免与四免方法与二免相同，用已建立的间接elisa检测小鼠血清效价，至血清效价达8000倍以上，100μgpet-32a-bcov-n蛋白直接注入小鼠腹腔，进行加强免疫，一周内进行细胞融合。

实施例3

实施例3说明杂交瘤细胞株建立：

1、sp2/0细胞的准备：

在融合前2周左右，复苏冻存的sp2/0细胞，用含20％胎牛血清的培养液在37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养，融合前12h对sp2/0细胞传代换液，融合时，用rpmi-1640将细胞轻轻吹下，1000r/min，离心5min，重复2次，同时对细胞计数，备用。

2、饲养层的准备：

取健康balb/c小鼠1只，断颈处死后，于乙醇中完全浸泡消毒，随后，大头针固定于解剖板上，镊子提起小鼠腹部皮肤，剪刀剪开，再用镊子完全撕开小鼠皮肤，使皮肤大面积暴露，同时用酒精棉对皮肤擦拭消毒，用5ml的一次性无菌注射器吸取含20％胎牛血清配以50×hat的rpmi1640培养液注入到小鼠腹腔中(注意：避免扎到肠道)，保持针头所处的位置不动，另一只手用止血钳夹着酒精棉球轻轻对小鼠腹部进行揉动按摩，再将腹腔中的液体慢慢抽取出来，注入无菌培养皿中，如此反复3～5次，以将小鼠腹腔中的巨噬细胞尽可能多的吸出，一共配50ml的含20％胎牛血清和1×hat的rpmi1640培养液，将吸取的巨噬细胞混匀于其中，并用多道移液器以100μl/孔的量加入到96孔细胞培养板中，一共可以铺满4-5个细胞培养板，然后放到37℃，5％co2培养箱中观察培养，约18～24h后看细胞生长状态，如果细胞没有污染且贴壁紧密，则可以作为饲养层细胞使用。

3、腘淋巴结细胞和脾细胞制备：

将加强免疫完3d后的balb/c小鼠摘除眼球并收集全血于1.5ml离心管中，4℃放置过夜，分离到的血清即为阳性血清，摘完眼球后，颈椎脱臼致小鼠死亡，并置于75％酒精中浸泡消毒5min，放置于经过紫外灭菌30min的生物安全柜的超净台工作台中，固定在泡沫板上，在生物安全柜中进行如下操作：一只手用高温高压灭菌过的镊子提起小鼠腹部皮肤，另一只手拿高温高压灭菌过的眼科剪小心地剪一个倒三角状开口，钝性撕开小鼠腹部的皮肤，完全暴露出腹膜，然后，小心剪开小鼠腹，无菌取出完整的小鼠脾脏放入已盛有无血清rpmi1640基础培养基的无菌平皿中，取1ml注射器吸取培养基，将脾脏轻轻刺破并缓慢洗吹，待脾脏颜色由深红色变为淡红色结束，弃去脾脏，剪子轻轻撕去大腿内侧皮肤，取出腘淋巴结，置于培养皿中，剪子剪去小鼠腹胸部左侧皮肤，取出脾脏，置于培养皿中，将腘淋巴结置于灭菌后的200目铜网上，用5ml注射器胶塞轻轻碾压腘淋巴结，随后弃去铜网和残余组织碎片，将腘淋巴结细胞和脾细胞混匀后，1000r/min，离心5min，重复2次，同时对细胞计数。

4、细胞融合：

将sp2/0细胞与脾细胞按1：8的比例(sp2/0细胞与腘淋巴细胞按1：5)进行混合，1000r/min，离心5min，弃尽上清，再次对混合细胞进行离心，1000r/min，5min，用胶头滴管吸弃上清液，用手指轻弹离心管底部细胞，打散混匀，500ml烧杯中加入水温为38℃的无菌蒸馏水400ml，将离心管浸入温水中，水浴静置2～3min，吸取37℃预热的peg1450750μl，沿离心管壁缓慢加入，添加时间为1min，同时轻轻吹起细胞数次，继续静置水浴30s，胶头滴管吸取1640基础培养基，沿管壁缓慢加入，1min内添加3ml，随后在4min内缓慢添加30ml1640基础培养基，800r/min，离心4min，弃去上清液，用30ml基础培养基缓慢吹洗细胞，800r/min，离心4min，弃去上清液，培养皿中添加50ml20％血清培养基及1mlhat，混匀，将融合后的细胞缓慢吹起，移至培养皿中，混匀，将细胞缓慢添加至含有饲养层细胞的96孔板中，每孔125μl，最后，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。

细胞融合常用的peg为peg4000和peg1450两种，peg4000分子量较大，细胞失水较快，融合较为剧烈，作用时间较短，但是对细胞的损伤也较大；peg1450分子量较小，细胞失水过程较慢，融合过程较为缓和，作用时间较长，操作过程容易控制，对细胞的损伤也较轻，因此本发明选择peg145作为细胞融合剂。

5、融合细胞的培养：

融合后第5d、8d和11d，可根据融合细胞数量和状态适当添加含有hat的20％血清培养基。融合后7-10d，96孔细胞培养板内的杂交瘤细胞克隆生长至约占底部1/4时，进行elisa检测筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，见图2，进一步进行亚克隆筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，经4次亚克隆后所有克隆化的细胞均呈单个集落分布且阳性检测率约为100％，即得到了5株相对稳定分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，将所获得的5株单克隆抗体分别命名为2f9、2e3、7a1、dc4和cb9。

6、阳性杂交瘤细胞株的克隆：

采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆，克隆前首先对制备饲养层细胞，方法同上，将需要克隆的的杂交瘤细胞在原孔内轻轻吹起，呈细胞悬液，十倍稀释后，对细胞进行计数，用1×ht和20％血清培养基将细胞稀释，并添加至含有饲养层细胞的96孔培养板中，添加浓度为1.5个/孔，7d后，待出现细胞堆后，显微镜观察，标记克隆数目，同时适量换液，用间接elisa法再次筛选阳性细胞株，筛选特异性好、效价高、生长状态佳的阳性细胞株，对阳性细胞进行多次克隆，方法同上，直至克隆后所有细胞堆检测均为阳性，停止克隆，将阳性细胞株转移至6孔板中进行扩大培养。

7、杂交瘤细胞的冻存：

选取对数生长期细胞，弃去上清液，用基础培养基轻轻吹起形成细胞悬液，并对悬液进行细胞计数，将悬液转移至15ml离心管中，1000r/min，离心5min，弃去上清，将血清和dmso按9：1的比例进行混合，缓慢添加至离心管中，轻轻吹起，形成细胞悬液，使细胞浓度达到1×10⁶，加入冻存管中，每管0.8ml，标记，封口，冻存管依次置于4℃，1h，-20℃，1h，-80℃过夜，次日置于液氮中长期保存。

8、细胞的复苏：

将冻存管从液氮中迅速取出，置于42℃的温水中，迅速摇晃，使冻存液迅速融化，75％乙醇表面消毒后，将冻存管1000r/min，离心5min，弃去上清，加入1ml基础培养基，轻轻悬浮细胞转移至5ml20％血清培养基的细胞瓶中，37℃，5％co2的培养箱中培养。

实施例4

实施例4说明单克隆抗体制备：

1、腹水法大量制备抗体：

取经产后的雌性balb/c小鼠数只，每只腹腔注射0.5ml已灭菌的液体石蜡，缓慢轻揉腹部2min，一周后，小鼠腹腔注入阳性杂交瘤细胞(每只/5×10⁵)，数天后，可见小鼠腹腔明显变大，14天后，直至小鼠腹腔肿胀且行动迟缓，取20ml注射器针头轻缓刺破腹部，收集腹水，置于37℃，1h，取出10000r/min，离心10min，取上清，-80℃保存。

选择2f9、2e3、7a1、dc4和cb9杂交瘤细胞株，腹腔接种氟氏完全佐剂致敏的balb/c系小白鼠，14d左右小鼠腹部极度膨大，精神萎靡，此时收集腹水，见图3，a：接种13d鼠，腹部显著变大，为对照鼠的3-5倍；b、c：收集腹水。

2、单克隆抗体效价的测定：

腹水从1万倍开始2倍稀释，至512万倍，加入酶标板中，100μl/孔，应用pet-32a-bcov-n蛋白作为抗原建立的间接elisa方法，以阴性腹水作对照，免疫鼠血清作为阳性对照，平行稀释的单抗od值与阴性对照od值比值大于2.1的最大稀释倍数，为抗体的效价。

按照已建立的elisa方法，测定5株阳性杂交瘤细胞株的细胞培养上清和制备的小鼠腹水抗体效价，按照2倍比稀释细胞培养上清，10倍比稀释所制备的腹水，测得的抗体效价结果显示2f9的培养细胞上清和腹水效价都是最高的，分别达到1：32000和1：10⁹，具体结果见表1：

表1杂交瘤细胞培养上清及制备的腹水抗体效价

试验例1

试验例1说明单抗的免疫活性和特异性鉴定：

1、westernblot鉴定：

准备好长满单层的hrt-18细胞，接种bcovdq株病毒到六孔板上，置于37℃，5％co2细胞恒温培养箱中孵育1h，弃上清，含有0.25％胰酶的dmem至2ml继续培养同时设置未处理组做空白对照，细胞病变(cpe)达到50％时，倒掉培养液，pbs洗两遍，加入150μl细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃12000rpm离心5min，收集上清，吸出80μl到1.5ml离心管中，再加入20μl5×的蛋白上样缓冲液，沸水中煮沸5min，-20℃保存备用，然后进行sds-page电泳，将产物转印至pvdf膜，以制备的杂交瘤细胞腹水单克隆抗体作为一抗，进行westernblot鉴定。

westernblot结果显示感染bcov的hrt-18细胞均能与7a1、2e3、cb9、dc4和2f9发生特异性反应，在55kda处产生免疫印迹，而对照组未出现免疫印迹，见图4，结果表明制备的单克隆抗体能够与bcovcd株发生特异性反应。

2、间接免疫荧光(ifa)试验：

将感染bcovdq3d的hrt-18细胞和未感染的细胞作为对照，以制备的杂交瘤细胞腹水单克隆抗体作为一抗，以dylight594标记山羊抗小鼠igg为二抗，进行ifa试验，同时选择牛常见病毒brv、bvdv、ibrv、bpiv3和brsv等进行特异性试验，以相应病毒的阳性血清或者单抗作为对照，二抗为fitc标记的抗牛igg，brv感染ma104细胞，其它病毒感染mdbk细胞。

制备的单克隆抗体7a1、2e3、cb9、dc4和2f9均能与感染bcov的hrt-18细胞反应产生红色荧光，而非感染对照组未见红色荧光，阴性对照仅放一组照片，其他与其相似，均无红色荧光，见图5。

7a1、2e3、cb9、dc4和2f9作为一抗，均不能与bvdv、bpiv3和ibrv感染的mdbk细胞，与brv感染的ma104细胞不能发生反应产生免疫荧光，而相应的阳性血清能够产生免疫荧光，具体结果见图6。

试验例2

试验例2说明单克隆抗体亚类的鉴定：

应用抗体亚类检测试剂盒对抗体亚类进行检测，抗体亚类包括igg1、igg2a、igg2b、igg3、igga、iggm，按sbaclonotyping^tmsystem/hrp抗体亚类鉴定试剂盒说明书操作，(可在细胞筛选过程中进行鉴定)。

结果显示5株单克隆抗体轻链均为kappa链，2e3、2f9的重链为igg2a，cb9、dc4和7a1的重链为igg1，具体结果见表2：

表2bcovn蛋白单克隆抗体亚类鉴定结果

试验例3

试验例3说明杂交瘤细胞染色体数的鉴定：

染色体计数采用秋水仙素法，步骤如下：

(1)将杂交瘤细胞和sp2/0细胞从培养箱取出；

(2)每瓶细胞中加入20μg/ml的秋水仙素0.05ml，使其终浓度达到0.1μg/ml，放入细胞培养箱中培养2.5h，使细胞染色体分裂停止在分裂中期；

(3)将细胞轻轻吹下，并加入到离心管中，1000r/min离心5min，弃掉上清液。使用移液枪吸取0.075mol/mlkcl溶液2ml重悬沉淀，放入37℃水浴锅中水浴30min；

(4)加入1ml细胞固定液(甲醇冰醋酸体积比为3:1)预固定2～3min，1000r/min离心5min，弃掉上清液。再加入1ml细胞固定液，室温固定2～3min，1000r/min离心5min。重复固定步骤一次；

(5)用固定液将细胞沉淀制成悬液用于涂片，一般情况加入200μl～500μl左右。加入固定液体积依照细胞沉淀的多少而定，可以做多个浓度的悬液选取效果最好的使用；

(6)滴加1-2滴细胞悬液于载玻片上，注意载玻片使用前反复擦拭几次，将载玻片晾干后，并预冷10min。使用giemsa染色液染色，通常染色时间为15～20min。最后用蒸馏水冲洗1-2次，室温晾干；

(7)分别选取杂交瘤细胞和sp2/0细胞各10个细胞，保证染色体分散良好、形态完整、无重叠、无散失，于显微镜下进行观察。对染色体进行计数，并求出染色体数目的平均值。

通过秋水仙素法对杂阳性杂交瘤细胞进行染色体计数，结果显示所有杂交瘤细胞株染色体分布均匀，且每条染色体清晰，杂交瘤细胞染色体数接近骨髓瘤细胞(55-65条)和小鼠脾细胞(40条)染色体数之和在95-105条之间，如图7。

试验例4

试验例4说明杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定：

将杂交瘤细胞株7a1、2e3、cb9、dc4和2f9连续传代3个月，3个月后复苏冻存的杂交瘤细胞，调整细胞生长状态，待其状态良好时，收集细胞上清液，使用间接elisa方法分别检测杂交瘤细胞上清效价。将抗体效价进行对比，确定其分泌抗体的稳定性，结果见表3，结果显示冻存前后分泌的抗体效价无显著变化，说明杂交瘤细胞株稳定性较好。

表3阳性杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定结果

试验例5

试验例5说明单克隆抗体针对的抗原表位分析：

利用叠加elisa方法对单克隆抗体的表位进行分析，分别以单克隆抗体2f9、2e3、dc4、7a1和cb9作为第一次孵育抗体，再分别以2f9、2e3、dc4、7a1和cb9为第二次孵育抗体进行检测，每个实验进行3次重复，步骤如下：

(1)以ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释bcov-n蛋白包被酶标板，100μl/孔(抗原浓度为2.5μg/ml)37℃包被1h；

(2)用pbst洗涤3次，每孔加入200μl1％明胶进行封闭，37℃封闭0.5h；

(3)用pbst洗板3次，按照1/10的比例用pbst将一种单抗杂交瘤细胞培养上清(2f9、2e3、dc4、7a1和cb9)进行稀释，100μl/孔，37℃孵育1.5h；

(4)在加入另一种单抗上清(2f9、2e3、dc4、7a1和cb9)(1/10稀释)，37℃作用1.5h，pbst洗3次；

(5)洗板3次，将hrp标记羊抗鼠igg按照1/5000进行稀释，100μl/孔，37℃孵育1h；

(6)洗板3次，加底物显色溶液tmb，100μl/孔，室温避光显色10min；

(7)最后加2mol/l硫酸终止反应，50μl/孔，测定od450nm值，当p/n>2.0时实验成立。

(8)结果计算，ai＝(a1.2–a1)/a2×100％

a1、a2为单独单抗的od值，a1.2为叠加单抗的od值，判定标准：ai>50％表明识别抗原位点不同，ai<50％为位点相似或相同。

利用叠加elisa方法对单克隆抗体的表位进行分析，具体结果见表4和表5：

表4单抗叠加elisa的od450值

表5单抗叠加elisa的ai值

结果表示2f9分别与2e3和dc4叠加elisa的ai值均大于>50％，识别的抗原表位不同，而2e3和dc4识别的抗原表位没有差异。

综上所述：本研究成功构建的5株抗bcov-n蛋白的杂交瘤细胞株，能够有效识别有感染活性的bcov粒子，而且具有较强的特异性，其中以2f9杂交瘤细胞株的效果为最好，为下一步制备bcov抗原检测试剂盒奠定了物质基础。