来自海洋的卵链菌MNH15及产酶方法与产品及应用与流程

本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港市海州湾的卵链菌(catenovulumsp.)mnh15cgmccno.17009；本发明还涉及该菌株的产右旋糖酐酶的方法与产品及应用。

背景技术：

右旋糖酐(dextean)主要是α-1,6-糖酐键连接的葡萄糖。右旋糖酐酶(dextranase,α-d-1,6-glucan-6-d-glucanohydrolase,ec3.2.1.11)，又叫α-葡聚糖酶，是一种专一性水解右旋糖酐中α-1,6糖酐键的水解酶。

现有技术的右旋糖酐酶能够降低多糖的相对分子质量，从而降低糖的粘度，运用于制糖工业中；在口腔疾病研究的领域中，右旋糖酐酶能水解由变异链球菌，乳杆菌等细菌产生的水溶性胞外多糖中的α-1，6糖酐键，使细菌表面粘附力下降，从而达到降解牙菌斑预防龋齿的目的。在食品工业中，右旋糖酐酶深度催化水解高分子右旋糖酐制备的功能性低聚异麦芽糖具有益生元特性；可用作生物保鲜剂，对于我国绿色农业的发展有着深远的意义；经水解不同程度的右旋糖酐可用作食品添加剂，可以提高食品的柔软度，增大食品的体积。

右旋糖酐酶可由青霉、曲霉、轮霉、黑曲霉、双歧乳杆菌等制得。为扩展右旋糖酐酶的来源，研究新的可产右旋糖酐酶的海洋细菌具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖酐酶的来自海洋细菌卵链菌mnh15。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的卵链菌mnh15的产右旋糖酐酶方法以与产品及应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种来自海洋的卵链菌(catenovulumsp.)mnh15(以下简称菌株mnh15)。本发明所涉及的菌株mnh15是在中国江苏省连云港市海州区海州湾的海泥中分离到的海洋细菌(catenovulumsp.)，该菌株已于2018年12月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmccno.17009，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010-64807355。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种如以上技术方案所述的来自海洋的卵链菌(catenovulumsp.)mnh15产右旋糖酐酶的方法，其特点是，其步骤如下：将卵链菌mnh15接种到2216e培养基中，转数180rpm，装液量20％，35℃培养9h得到种子液；将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养48h，10000rpm离心15min，取上清液即右旋糖酐酶粗酶；所述的产酶培养基的组成为：酵母粉1％，豆粕0.5％，右旋糖酐t208g/l，nacl5g/l，ph8.0。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种右旋糖酐酶，其特点是，该右旋糖酐酶是采用卵链菌(catenovulumsp.)mnh15，利用上述产酶方法所产的右旋糖酐酶。

本发明还公开了一种右旋糖酐酶的用途，其特点是：该用途为将右旋糖酐酶用于对生物膜的抑制剂或清除剂。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

本发明提供了一种新的来自海洋的卵链菌(catenovulumsp.)mnh15cgmccno.17009。本发明的卵链菌mnh15可产对生物膜有抑制或清除作用的右旋糖酐酶，拓展了右旋糖酐酶的来源与用途。

附图说明

图1为菌株mnh15扫描电镜照片形态(x5000)图；

图2为菌株mnh15在初筛平板上形成的透明圈；

图3为菌株mnh15系统进化树；

图4为温度对菌株mnh15生长的影响；

图5为nacl浓度对菌株mnh15生长的影响；

图6为ph对菌株mnh15生长的影响；

图7为碳源对产酶的影响；

图8为氮源对产酶的影响；

图9为温度对产酶的影响；

图10为培养基ph对产酶的影响；

图11为发酵时间对产酶的影响；

图12为装液量对产酶的影响；

图13为诱导剂对产酶的影响；

图14为温度对酶作用的影响；

图15为酶的热稳定性；

图16为ph对酶作用的影响▲乙酸乙酸钠缓冲液，●磷酸钠缓冲液，■tris-hcl缓冲液；

图17为酶ph稳定性■乙酸钠缓冲液，●磷酸钠缓冲液，▲tris-hcl缓冲液；

图18为菌株mnh15右旋糖酐酶的水解产物m：标准品；g1-g6:葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽七糖；s1-s5；0h，0.5h，1h，2h，3h；

图19为菌株mnh15右旋糖酐酶对生物膜作用的电镜图。

本发明卵链菌(catenovulumsp.)mnh15已于2018年12月19日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc,保藏编号为cgmccno.17009。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种来自海洋的卵链菌mnh15(catenovulumsp.)cgmccno.17009。该菌株具有一下特征：菌株mnh15为革兰氏阴性短杆菌；在含有蓝色葡聚糖的固体培养基上的菌落特征：表面光滑，湿润、边缘整齐、白色不透明菌落；该菌株甲基红反应呈阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性，能利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖、蕈糖。该菌株在0℃不能生长，最适生长温度为35℃；生长的ph适宜范围为6-10，最适生长ph为8.0；在nacl浓度为1％-7％时可以生长，最适生长nacl浓度为2％。以下进行详细的描述：

1、菌株的筛选方法

1.1涉及的培养基：

2216e培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配制，ph8.0。初筛培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蓝色葡聚糖20000.2％，右旋糖酐t201％，琼脂2％，陈海水配制，ph8.0。

产酶培养基：酵母粉1％，豆粕0.5％，右旋糖酐t208g/l，nacl5g/l，ph8.0。

种子培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，陈海水配制，ph8.0。

微量矿物盐溶液(每升)：

cuso4·5h2o,0.01g；znso4·7h2o,0.1g；cocl2·6h2o,0.005g；mncl2·4h2o,0.2g；na2moo4·2h2o,0.1g；kbr,0.05g；ki,0.05g；h3b03,0.1g；naf,0.05g；licl,0.05g；al2(so4)3,0.05g；nicl2·6h2o,0.01g；voso4·2h2o,0.005g；h2wo4·2h2o,0.002g；na2seo4,0.005g；srcl·6h2o,0.005g；bacl2,0.005g。

1.2菌株的筛选方法：

海泥直接取1g放入50ml2216e培养基中，20℃、180r/min培养2-5d。选取合适的培养液的稀释液涂布初筛培养基，20℃培养3-4d，菌落长出后加入95％乙醇，-20℃冷冻3～4h，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的单菌落菌株接入产酶培养基，20℃、180r/min培养2d，10000r/min离心15min取上清液测定酶活力大小。选出透明圈较大和酶活力较高的菌株。

2、菌株mnh15的形态特征与生理生化特征。

2.1形态特征：

菌株mnh15为革兰氏阴性杆菌(见图1)，菌株mnh15无芽孢，无鞭毛，在2216e固体培养基中培养48h后，菌落呈边缘整齐光滑、浅白湿润。在含有蓝色葡聚糖的固体培养基中，能产生透明圈(见图2)。

2.2生理生化特征：

该菌株甲基红反应呈阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性，能利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖、蕈糖。部分生理生化结果见表1。

表1菌株mnh15的生理生化特征

注：+：阳性；-：阴性

2.3菌株mnh15的分子生物学鉴定

用takara试剂盒提取菌株mnh15的基因组，选用扩增原核微生物16srdna序列的通用引物(27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-ggttaccttgttacgctt-3’)。反应体系50μl，taq酶，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退货30s，72℃延伸90s，72℃延伸10min。将pcr产物电泳纯化回收构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海生工测序，将测得序列互补反向拼接，获得1500bp的碱基片段序列。将菌株mnh15的16srdna基因序列提交genbank数据库，通过16srdna序列同源性比较，可以初步确定改菌株为卵链菌(catenovulum)。将亲缘关系较近的菌株16srdna运用mega软件进行多重比较，用中邻接法(neibor-joingmethod)建系统进化树，从进化树表明菌株mnh15与catenovulum亲缘关系最近。参见图3。

3、菌株mnh15的生长特性

本发明提供的菌株mnh15，对其生长特性进行了细致的研究，获得了该菌株的生长条件。

3.1种子液的制备：将菌株mnh15斜面种子接种到2216e培养基中，30℃，180rpm，装液量20％，培养9h。

3.2温度对菌株mnh15生长的影响：

将种子液以2％接种量于2216e培养基中，ph8.0，转数180rpm，装液量20％，分别在不同温度下培养6h，选择在600nm波长下测定od值，该菌株在0℃下不能生长，该菌株温度范围为20-40℃，最适生长温度为35℃，见图4。

3.3nacl对菌株mnh15生长的影响：

按照3.1方法制备种子液，在2216e培养基(将陈海水改用微量矿物盐溶液代替)中加入nacl，使之为0％-10％的nacl，在35℃培养8h，测定细胞浓度，生长的nacl浓度为1％-7％，最适生长nacl浓度为2％，见图5。

3.4ph对菌株mnh15生长的影响：

在2216e培养基(将陈海水改用微量矿物盐溶液代替)加入终浓度为10mmol/l的不同ph的缓冲液(mes、pipes、hepes、naoh)，使培养基ph分别为4.0-10.0之间，再加入浓度为2％的nacl，35℃培养8h，测定细胞浓度，生长ph范围为6.0-10.0，最适生长ph为8.0，见图6。

实施例2，一种如实施例1所述来自海洋卵链菌mnh15产右旋糖酐酶的方法，其步骤如下：将卵链菌mnh15接种到2216e培养基中，转速180rpm，装液量20％，30℃培养9h得到种子液；将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养48h，10000rpm离心15min，取上清液再用10000的中空纤维滤膜超滤浓缩得到粗酶液。以下进行详细的说明：

4、菌株mnh15产右旋糖酐酶的方法

4.1碳氮源对菌株mnh15产酶的影响：

碳源：1％的碳源(酵母粉、马铃薯、乳糖、木薯、玉米粉、葡萄糖、麦芽糖麸皮、蔗糖、糊精)和0.5％的氮源(鱼粉蛋白胨、花生粕、尿素、干酪素、豆粕、氯化铵、硝酸钠、硫酸铵)用于替换发酵培养基中的酵母粉和蛋白胨，接种后在30℃摇床培养48h后分别测酶液的活力。结果发现，酵母粉和马铃薯淀粉作为培养基碳源可促进产右旋糖酐酶，而干酪素和豆粕作为氮源时对产酶的促进也较为可观，其次，鱼粉蛋白胨和花生粕也有利于产酶，见图7-8，考虑到成本，选用1％酵母粉和0.5％豆粕作为产酶培养基的碳氮源。

4.2发酵温度对菌株mnh15产酶影响：

将接种培养9h的种子培养基以3％接种量接种至发酵培养基，于15-40℃培养48h后分别测酶液的活力，结果见图9。菌株mnh15最佳产酶温度为30℃，低于20℃或高于40℃，产酶量均有大幅度下降。

4.3培养基初始ph对菌株mnh15产酶的影响：

以3％接种量接种至不同初始ph的发酵培养基，于30℃培养48h后分别测酶液的活力。初始ph调节范围为5-10。培养基初始ph对产酶的研究结果表明，培养48h，该菌株产酶的最适初始ph为8.0。随着ph的升高和下降，菌株的产酶均受到较大影响，当ph低于6.0时，由于菌株mnh15几乎不生长，其发酵液测不到明显酶活力，见图10。

4.4发酵时间对菌株mnh15产酶的影响：

将菌株mnh15发酵24h且每隔6h取样测酶活力，结果表明48h为产酶高峰，在48h之前菌株随着发酵时间延长产酶逐渐升高，而继续监控酶活力发现没有太大的变化趋势，结果如图11所示。

4.5装液量对菌株mnh15产酶的影响：

以3％接种量分别接种至装液量为20-90ml/250ml的发酵培养基，于30℃180rpm摇床中培养48h后分别测酶液的活力。通过控制锥形瓶中培养基的体积来控制发酵液的溶氧，进而研究其对菌株产酶的影响，图12显示最适装液量为60ml/250ml。

4.6不同诱导剂浓度对产酶的影响：

将右旋糖酐t20作为产酶诱导剂，将不同浓度的右旋糖酐t20加入发酵培养基中，接种培养后分别测酶液的活力。随着诱导剂浓度增大产酶逐渐增加，到达最佳浓度后缓慢下降。如图13所示，8g/l的右旋糖酐t20为最佳产右旋糖酐酶诱导剂浓度，超过8g/l是酶活力下降，不添加右旋糖酐检测不到酶活力。

实施例3，一种如实施例2所述的方法产右旋糖酐酶，该右旋糖酐酶具有以下特征：右旋糖酐酶的适合作用温度为40℃，5℃仍有20％的酶活力，在5℃～45℃温度范围时有催化活力,产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在40℃下保温5h后酶活仍能保持80％以上，45℃的半衰期是5h；该酶在ph5.0～8.0的范围内稳定。以下进行详细的阐述：

5菌株mnh15右旋糖酐酶的性质

5.1粗酶液的制备：

将卵链菌mnh15(catenovulumsp.)菌株接种到2216e培养基中，转数180rpm，装液量20％，培养9h，得种子液以3％的接种量至产酶培养基中，180rpm，30℃培养48h后，将酶液10000rpm离心15min，取上清液，用一万的中空纤维滤膜，5000rpm进行超滤浓缩3倍，4℃保藏备用。

5.2酶作用温度对酶活性的影响：

将右旋糖酐酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图14，酶的最适作用温度为40℃，在20℃-50℃温度范围时有较高的催化活力，在0℃仍有酶活力。

5.3酶的热稳定性：

取适量酶液置于不同温度(30℃、40℃、50℃)下保温5h，每隔1h取一组样品，迅速冷却置于4℃冰箱保存，待保温结束后统一标准条件下测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活力设为100％，结果见图15，在40℃下保温5h后仍具有80％以上的酶活力，45℃的半衰期是5h。

5.4酶的作用ph对酶活性的影响：

将酶液与在不同ph的1.0％的右旋糖酐溶液中在40℃下进行酶活力的测定，不同ph的缓冲液为：50mm乙酸钠缓冲液(ph4.0-6.0)、50mm磷酸钠缓冲液(ph6.0-7.5)和50mmtris-hcl缓冲液(ph7.5-9.0)。结果见图16，该酶液的最适作用ph为8。

5.5酶的ph稳定性：

将适当酶液与不同ph的缓冲液(按照5.4中的缓冲液)混合，在25℃水浴锅中保温1h取出测酶活，将未处理酶液的酶活设为100％。结果见图17，结果表明在25℃保温1h后，右旋糖酐的酶活力在ph5.0-8.0范围内稳定，残余酶活力保持在80％以上，在ph4.0时有70％的残余酶活。

5.6金属离子、化学试剂对酶的作用：

金属离子与酶液混合，使其终浓度达到1.0mm、5mm、10mm，然后在30℃，处理30min后，测定酶活力并以不含化学试剂的酶液对照计算相对酶活力，结果见表2，结果发现ba²⁺、ni²⁺、cd²⁺、fe³⁺co²⁺、cu²⁺、ni⁺、zn²⁺对酶稳定性有不同程度的作用；10mm的k⁺、nh⁴⁺对酶稳定性的影响较大，其他金属离子如：ca²⁺、mg²⁺、sr²⁺对酶稳定性影响不大；化学试剂乙醇对酶稳定性有一定的影响，结果表3所示。

表2金属离子对右旋糖酐酶稳定性的影响

表3化学试剂对右旋糖酐酶活性的影响

5.7菌株mnh15右旋糖酐酶底物特异性：

将多种不同底物(右旋糖酐t20、右旋糖酐t40、右旋糖酐t70、右旋糖酐t500、右旋糖酐t2000、可溶性淀粉、普鲁兰多糖、几丁质)于50mmol/ltris-hcl缓冲液(ph8.0)中，在标准条件下测量酶活力，结果如表4，菌株mnh15右旋糖酐酶能特异催化有α-1,6糖酐键组成的化合物-不同分子量的右旋糖酐，对有α-1，4和α-1，6糖酐键组成的可溶性淀粉接近5％的催化活力。

表4菌株mnh15右旋糖酐酶底物特异性

5.8右旋糖酐酶活的测定：

①右旋糖酐酶活测定方法：将50μl酶液加入到150μl3％的右旋糖酐t20的tris-hcl缓冲液(0.1mol/l，ph8.0)中，在40℃水浴中反应15min，加入200μldns，沸水浴中煮沸5min，终止反应并显色，加入3ml去离子水震荡混匀，取200μl与96孔酶标板上与540nm下进行吸光值测定。

②酶活力单位定义(u/ml)：在一定温度和ph下，每分钟催化产1umol还原糖的酶量为一个活力单位。

实施例4，菌株mnh15右旋糖酐酶的应用：

将右旋糖酐酶运用于对生物膜的抑制与清除，其步骤如下：首先制备变异链球菌菌悬液：将变异链球菌按照2％的比例接种至bhi培养基中37℃厌氧培养18h后，4℃10000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体，将菌浓度最终调od550＝1.0。mbic的测定：即药物最低抑制生物膜形成浓度，用于评估药物对生物膜形成的抑制。用微孔板法测定mbic。不同浓度右旋糖酐酶对生物膜形成的影响：无菌盖玻片置于24孔板中，将菌悬液与含1％蔗糖的bhi培养基按照1:9的比例加入。37℃厌氧培养24h后取出盖玻片，用蒸馏水轻柔洗涤后，2.5％戊二醛低温固定2-3h，缓冲液漂洗2-3次，1％ph7.2锇酸低温固定1.5-2h。然后酒精梯度脱水(50％、70％、80％、90％、100％)，每个梯度脱水15min。样品干燥后喷金扫描电镜观察。以下进行详细的阐述：

6.1菌株mnh15右旋糖酐酶的水解产物：

本发明方法所产右旋糖酐酶在制糖工业的作用。将右旋糖酐酶水解不同时间的产物进行薄层层析分析(图18)。对照标准品发现，酶水解右旋糖酐t5003h后可见产物主要为葡萄糖和麦芽糖和麦芽四糖，表明该右旋糖酐酶为内切型右旋糖酐酶。

6.2菌株mnh15右旋糖酐酶对生物膜的影响：

mbic测定结果如表5所示。结晶紫染色法表明右旋糖酐酶对牙菌斑生物膜的形成有良好的抑制作用，随着右旋糖酐酶浓度的增大，生物膜的形成量逐渐减少。右旋糖酐酶的浓度在3u/ml、7u/ml时生物膜形成的抑制率分别为52.30％和91.79％。即右旋糖酐酶的mbic50约为3u/ml，mbic90约为7u/ml。

根据右旋糖酐酶对最低生物膜形成抑制浓度mbic的测定结果，再用扫描电镜观察对菌株mnh15右旋糖酐酶对生物膜形成的影响，结果见图19所示，空白组即0u/ml，生物膜结构致密，加酶组，随着右旋糖酐酶浓度的增加，生物膜受到不同程度的抑制作用。

表5不同浓度右旋糖酐酶对生物膜的抑制率

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