ZmG2在提高植物强光胁迫抗性和产量中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中，zmg2在提高植物强光胁迫抗性和产量中的应用。
背景技术：
：光是地球上植物进行光合作用的能量来源，但是当植物光合机构吸收的光能超过光合作用所能利用的量时，过剩的光能引起光能转化效率的下降，甚至会引起光合机构的光氧化损害，这称为光抑制现象。在没有其它环境胁迫的条件下，光抑制可以使植物的光合生产力降低10％以上。光抑制主要发生在光合元件的光系统ii(psii)中，特别是在高温干旱的环境中，光抑制是植物抵御外界胁迫的保护性反应。光抑制包括了光保护和光破坏两方面，主要表现为psii的最大光化学效率(以荧光参数fv/fm表示)和光合效率的降低，光抑制的程度取决于光合机构保护机制的修复与psii反应中心破坏两方面的平衡状态。psii反应中心d1蛋白是psii的核心蛋白，是强光对光合机构破坏的主要靶点。光抑制导致d1蛋白被氧化失活，并最终使其降解，同时d1蛋白又是叶片中周转代谢最快的蛋白，正常条件下其半衰期仅20-30min，通过不停的周转来维持其动态平衡。研究表明，强光直接抑制d1蛋白的生物合成，使其修复速率低于降解速率，会累积光损伤，加剧光抑制程度。当光能过剩时，以非光化学淬灭(npq)为主要形式的热耗散是有效保护植物免受高光抑制的重要途径，demmig-adams等研究证实叶黄素循环在光抑制中具有调节过剩光能耗散的重要作用。植物在长期进化过程中通过其结构进化、光合途径的改变和提高光合运转等来调节保护光抑制，其中c4植物光合循环保持较高电子传递效率、减轻光抑制，对光抑制的保护最有效。强光对光抑制的影响效果非常明显，中午阳光最强烈，而相应的c3植物光合速率有明显的下降。c3作物水稻在其生育期内，特别是在后期抽穗灌浆期间需要消耗大量的能量，而由于高光照引起的光抑制和光氧化伤害，可导致叶片光合能力下降、灌浆不良，并直接引起产量的下降。因此如何通过提高水稻对由于高光引起光抑制的抵御能力，充分有效地利用光能资源，是进一步提升植物产量、实现稳产高产的关键问题之一。技术实现要素：本发明的目的是提供一种来自于玉米(zeamaysl.)的蛋白质(其名称为zmg2)在提高植物强光胁迫抗性和产量中的应用。本发明首先提供了zmg2或调控zmg2活性或含量的物质的下述任一应用：d1)调控植物产量或制备调控植物产量的产品；d2)调控植物光胁迫抗性或制备调控植物光胁迫抗性的产品；d3)调控植物d1蛋白运转能力或制备调控植物d1蛋白运转能力的产品；d4)调控植物d1蛋白含量或制备调控植物d1蛋白含量的产品；d5)培育产量提高植物或制备培育产量提高植物的产品；d6)培育光胁迫抗性提高植物或制备培育光胁迫抗性提高植物的产品；d7)培育d1蛋白运转能力提高植物或制备培育d1蛋白运转能力提高植物的产品；d8)培育d1蛋白含量提高植物或制备培育d1蛋白含量提高植物的产品；zmg2为如下a1)、a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；a2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a2)中的蛋白质，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列5所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列5所示的dna分子编码序列4所示的蛋白质。本发明还提供了与zmg2相关的生物材料的下述任一应用：d1)调控植物产量或制备调控植物产量的产品；d2)调控植物光胁迫抗性或制备调控植物光胁迫抗性的产品；d3)调控植物d1蛋白运转能力或制备调控植物d1蛋白运转能力的产品；d4)调控植物d1蛋白含量或制备调控植物d1蛋白含量的产品；d5)培育产量提高植物或制备培育产量提高植物的产品；d6)培育光胁迫抗性提高植物或制备培育光胁迫抗性提高植物的产品；d7)培育d1蛋白运转能力提高植物或制备培育d1蛋白运转能力提高植物的产品；d8)培育d1蛋白含量提高植物或制备培育d1蛋白含量提高植物的产品；所述生物材料为下述b1)至b7)中的任一种：b1)编码zmg2的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。上述应用中，b1)所述核酸分子可为如下b11)-b15)中的任一种：b11)编码序列是序列表中序列5的cdna分子或dna分子；b12)序列表中序列5所示的cdna分子或dna分子；b13)序列表中序列6的所示的dna分子；b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码zmg2的cdna分子或dna分子；b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码zmg2的cdna分子或dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码zmg2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的zmg2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码zmg2蛋白质且具有zmg2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，b2)所述的含有编码zmg2蛋白质的核酸分子的表达盒(zmg2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达zmg2蛋白质的dna，该dna不但可包括启动zmg2基因转录的启动子，还可包括终止zmg2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述zmg2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、psn1301或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为双元载体pvec8-gateway。b3)所述重组载体具体可为pvec8-zmg2。所述pvec8-zmg2为在pvec8-gateway的zmubi启动子的下游插入序列表中序列5所示的dna片段得到的重组载体。所述pvec8-zmg2能表达zmg2，zmg2编码基因的表达由玉米ubiquitin(zmubi)的启动子驱动。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌eha105。上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。上述应用中，所述调控植物产量可为提高植物产量；所述调控植物光胁迫抗性可为提高植物光胁迫抗性；所述调控植物d1蛋白运转能力可为提高植物d1蛋白运转能力；所述调控植物d1蛋白含量可为提高植物d1蛋白含量。所述产量可为植物的地上部生物量或籽粒产量；所述光胁迫可为强光胁迫；所述d1蛋白含量可为叶片中d1含量。上述应用中，所述植物可为c3植物或c4植物。进一步，所述c3植物可为m1)-m3)中的任一种：m1)单子叶植物或双子叶植物；m2)禾本科植物；m3)水稻。本发明还提供了下述x1)-x8)中任一方法：x1)提高植物产量的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比产量提高的目的植物，实现产量的提高；x2)培育产量提高植物的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比产量提高的目的植物；x3)提高植物光胁迫抗性的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比光胁迫抗性提高的目的植物，实现植物光胁迫抗性的提高；x4)培育光胁迫抗性提高植物的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比光胁迫抗性提高的目的植物；x5)提高植物d1蛋白运转能力的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比d1蛋白运转能力提高的目的植物，实现植物d1蛋白运转能力的提高；x6)培育d1蛋白运转能力提高植物的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比d1蛋白运转能力提高的目的植物；x7)提高植物d1蛋白含量的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比d1蛋白含量提高的目的植物，实现植物d1蛋白含量的提高；x8)培育d1蛋白含量提高植物的方法，包括：使受体植物中表达zmg2，或提高受体植物中zmg2的含量，或提高受体植物中zmg2的活性，得到与所述受体植物相比d1蛋白含量提高的目的植物。上述方法中，x1)-x8)所述方法均可通过向所述受体植物中导入zmg2的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。上述方法中，所述编码基因可为b1)所述核酸分子。上述方法中，其中所述zmg2的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述zmg2的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的gc含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中gc含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。所述zmg2的编码基因可利用含有所述zmg2的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pvec8-zmg2。所述重组表达载体可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition).)。所述目的植物理解为不仅包含zmg2蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。上述方法中，所述产量可为植物的地上部生物量或籽粒产量；所述光胁迫可为强光胁迫；所述d1蛋白含量可为叶片中d1含量。所述受体植物可为c3植物或c4植物。进一步，所述c3植物可为m1)-m3)中的任一种：m1)单子叶植物或双子叶植物；m2)禾本科植物；m3)水稻。本发明还提供了具有如下d1)-d8)中任一功能的产品，所述产品含有zmg2或所述生物材料：d1)调控植物产量；d2)调控植物光胁迫抗性；d3)调控植物d1蛋白运转能力；d4)调控植物d1蛋白含量；d5)提高植物产量；d6)提高植物光胁迫抗性；d7)提高植物d1蛋白运转能力；d8)提高植物d1蛋白含量。所述产品可以以zmg2或所述生物材料作为其活性成分，还可将具有相同功能的物质与zmg2或所述生物材料组合在一起作为其活性成分。上述产品中，所述产量可为植物的地上部生物量或籽粒产量；所述光胁迫可为强光胁迫；所述d1蛋白含量可为叶片中d1含量。所述植物可为c3植物或c4植物。进一步，所述c3植物可为m1)-m3)中的任一种：m1)单子叶植物或双子叶植物；m2)禾本科植物；m3)水稻。本发明中，所述提高植物光胁迫抗体可体现在植物叶片中d1蛋白运转能力提高和/或植物叶片中d1蛋白含量的增加和/或植物叶片fv/fm值的增加上。所述强光可光照强度高于植物正常需要的光。在本发明的一个实施例中，所述强光为光照强度为1200μmol·m-2·s-1的光。实验证明，本发明的zmg2及其编码基因可以提高植物抵御高光抑制的能力以及生物量与产量：向植物中导入zmg2的编码基因得到的转基因植株与野生型植物相比植物抵御高光抑制的能力以及生物量与产量均得到提高，表明，本发明的zmg2及其编码基因具有广泛的应用前景。附图说明图1为转基因水稻中插入zmglk1和zmg2基因的拷贝数及基因表达水平检测结果。a为zmglk1和zmg2基因的拷贝数检测结果，每个株系检测三个植株，对应于图中的三个泳道；b为zmglk1和zmg2基因的表达水平检测结果，ck为阴性对照植株。图2为高光处理4小时各待测水稻的fv/fm变化曲线。a为水处理对照组，b为林肯霉素处理组。**表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.01)。图3为恢复12小时各待测水稻的fv/fm变化曲线。c为水处理对照组，d为林肯霉素处理组。*表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.05)。图4为高光处理0h和4h后野生型水稻和转zmglk1和zmg2基因水稻的d1蛋白含量的westernblot检测结果。每泳道上样量均为15μg，其中1/4wt表示上样量为wt的1/4，1/2wt表示上样量为wt的1/2。0hhl-h2o表示水处理对照组高光处理0小时，0hhl-lin表示林肯霉素处理组高光处理0小时，4hhl-h2o表示水处理对照组高光处理4小时，4hhl-lin表示林肯霉素处理组高光处理4小时，lsu表示考马斯亮蓝染色后的rubisco大亚基条带作为内参。图5为野生型水稻和转基因水稻在北京和海南的地上部生物量及产量。单株产量为单株籽粒产量，小区产量为小区籽粒产量。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。donorvectorpdonrtm207:invitrogen。下述实施例中的双元载体pvec8-gateway(destinationvectorpvec8-gateway)(kim,c.m.&dolan,l.roothairdefectivesix-likeclassigenespromoteroothairdevelopmentinthegrassbrachypodiumdistachyon.plosgenet.12,e1006211(2016).)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的水稻粳稻品种kitaake(wang,p.etal.re-creationofakeystepintheevolutionaryswitchfromc3toc4leafanatomy.curr.biol.27,3278-3287(2017).)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、zmglk1和zmg2可以提高水稻抵御高光抑制的能力以及生物量与产量本实施例提供了两个来自于玉米品种b73的蛋白质，其名称分别为zmglk1和zmg2，这两个蛋白质均可以提高水稻抵御高光抑制的能力，从而大幅提高转基因水稻的生物量以及产量。zmglk1的氨基酸序列为序列表中序列1，在玉米品种b73中，编码zmglk1的基因组序列为序列表中序列3，cds序列为序列2；zmg2的氨基酸序列为序列表中序列4，在玉米品种b73中，编码zmg2的基因组序列为序列表中序列6，cds序列为序列5。1、重组表达载体的构建通过bp反应，先将两个基因的cds克隆至载体pdonrtm207中，经测序正确后通过lr反应将玉米ubiquitin(zmubi)的启动子及基因克隆至双元载体pvec8-gateway，构建得到重组表达载体，将得到的含有zmglk1的cds序列的重组载体记为pvec8-zmglk1，将得到的含有zmg2的cds序列的重组载体记为pvec8-zmg2。具体构建方法如下：载体构建：通过pcr从玉米品种b73cdna中扩增得到含有zmg2(genbankaccessionnumberaf318579)或zmglk1(genbankaccessionnumberaf318580)全长cdna的pcr产物，然后利用这两个pcr产物通过bp反应分别将zmg2和zmglk1的全长cdna克隆进入donorvectorpdonrtm207中，将序列正确的重组载体分别命名为207-zmglk1和207-zmg2。所使用引物(带有边界序列)为:zmg2基因：zmg2-cloningf：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgcttgaggtgtcgacgctg-3′；zmg2-cloningr：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttagtatgtcatccggtggcgc-3′；zmglk1基因：zmglk1-cloningf：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgcttgcagtgtcgccgtc-3′；zmglk1-cloningr：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatccacaagcttgcggcac-3′。207-zmglk1和207-zmg2经测序正确后通过lr反应将目标cdna克隆进入destinationvectorpvec8-gateway中zmubi启动子的下游，将序列正确的重组载体分别记为pvec8-zmglk1和pvec8-zmg2。pvec8-zmglk1为在pvec8-gateway的zmubi启动子的下游插入序列表中序列2所示的dna片段得到的重组载体，该重组载体能表达zmglk1蛋白质，zmglk1编码基因的表达由玉米ubiquitin(zmubi)的启动子驱动。pvec8-zmg2为在pvec8-gateway的zmubi启动子的下游插入序列表中序列5所示的dna片段得到的重组载体，该重组载体能表达zmg2蛋白质，zmg2编码基因的表达由玉米ubiquitin(zmubi)的启动子驱动。2、水稻转化与转基因植株的鉴定将步骤1得到的pvec8-zmglk1和pvec8-zmg2分别导入农杆菌eha105中后，利用农杆菌介导的水稻遗传转化方法转化水稻粳稻品种kitaake(即野生型水稻，wt)，分别得到转zmglk1基因水稻和转zmg2基因水稻，并利用后代鉴定过程中分离得到的不含有zmglk1基因或zmg2基因的植株作为阴性对照植株。通过southernblot检测两个转zmglk1基因水稻株系(zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3)和两个转zmg2基因水稻株系(zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3)中插入外源基因的拷贝数(图1中a)，所用探针均为：f-cttctacacagccatcggtc，r-ccgatggtttctacaaagatcg。qrt-pcr检测其转入zmglk1和zmg2基因的相对表达水平，利用水稻粳稻品种kitaake(wt)和阴性对照植株(ck)作为对照，检测步骤如下：检测转zmglk1基因水稻中zmglk1基因的相对表达水平所用引物为：5′-ggacctggatttcgacttca-3′，5′-cactcccctttcccttcttc-3′；检测转zmg2基因水稻中zmg2基因的相对表达水平所用引物为：5′-catggtggacgacaacctc-3′，5′-cacatgtttgctccaacgac-3′；内参基因均为水稻actin，内参基因引物为：5′-ggcaccacaccttctacaat-3′，5′-ctcacaccatcaccagagt-3′。结果显示，两个转zmglk1基因水稻(zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3)中zmglk1基因的相对表达水平均显著高于wt和ck，两个转zmg2基因水稻(zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3)中zmg2基因的相对表达水平均显著高于wt和ck，wt和ck均无zmglk1基因和zmg2基因的表达，图1中b。3、转基因水稻的光抑制实验待测水稻：野生型水稻，阴性对照植株，zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3，zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3。温室里水培生长5周大的待测水稻幼苗，将其叶片剪下随机分为两组，一组为水处理对照组，一组为林肯霉素处理组，将水处理对照组的叶片浸泡于水中，将林肯霉素处理组的叶片浸泡于1mm林肯霉素(合成d1蛋白的抑制剂)水溶液中，在室温适应3小时(光强为20-30μmol·m-2·s-1)。随后将各组叶片置于1200μmol·m-2·s-1光照强度的led灯下照射4小时进行高光处理，每小时取叶片测定fv/fm值，同时取样于液氮中速冻。高光处理4小时后，然后再将各组叶片置于室温及室内光照下恢复12小时，并用fluorpenfp100手持式叶绿素荧光仪(photonsystemsinstruments)测定fv/fm值。将高光处理0h和4h的样品研磨并提取蛋白进行westernblot实验，用sds-page胶电泳分离蛋白并转膜，所用一抗为d1蛋白抗体(agrisera,货号as05084)，二抗为羊抗兔igg-hrp抗体(agrisera,货号as09602)。fv/fm值变化如表1所示。表1、fv/fm值表1中，glk1-2、glk1-3、g2-2和g2-3分别为zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3、zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3。**表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.01)，*表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.05)。结果显示，植物经高光照射后，最直观的指标是psii的光化学效率(fv/fm值)下降。在水处理对照组中，野生型水稻和转基因水稻的fv/fm值均以较平缓的速率从0.8降至0.6左右，而且各转基因水稻的值高于野生型水稻(图2中a)。在水处理对照组的恢复过程中，同样可以观察到野生型水稻与转基因水稻相似，二者的fv/fm值在12小时后都最终可恢复到0.8左右(图3中c)。林肯霉素是叶绿体中蛋白合成的抑制剂，可以抑制d1蛋白的周转，从而阻断了psii的恢复过程。在高光处理且有林肯霉素存在的条件下，野生型水稻叶片的fv/fm值从1h起即急剧地下降，至4h时其fv/fm的值仅为暗适应时的21％，说明其psii受到了严重的破坏。而转基因水稻，特别是转zmg2基因水稻，在高光处理过程中，其fv/fm值始终高于野生型水稻，并且在4h后fv/fm值为野生型水稻的近2倍(图2中b)。在恢复过程中，转基因水稻的恢复速率也较野生型水稻更快，最终可恢复到比野生型水稻更高的水平(图3中d)。而整个过程中野生型水稻与阴性对照植株均无明显变化。进一步用westernblot对高光处理叶片的d1蛋白水平进行检测，结果表明在高光处理之前，转基因水稻的d1蛋白含量已经高于野生型水稻。在4小时高光处理后，野生型水稻叶片中的d1蛋白大量减少，而转基因水稻特别是转zmg2基因水稻中的d1蛋白仍保持在较高的水平，二者之间的差异在林肯霉素处理条件下更为明显(图4)。以上结果表明转入zmglk1和zmg2基因后，转基因水稻d1蛋白含量提高，并且抵御高光胁迫的能力大幅提升。而整个过程中野生型水稻与阴性对照植株中d1蛋白的含量均无明显变化。4、转基因水稻在大田中的产量提高检测水稻的地上部干重和籽粒产量，待测水稻：野生型水稻(wt)，阴性对照植株(ck)，zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3，zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3。经在北京和海南两地进行的大田实验，均表明转基因水稻的地上部干重及籽粒产量均较野生型有显著的提高。不管是在北京还是海南，转zmg2基因水稻的地上部干重均显著或极显著的高于野生型。由产量结果来看，转zmglk1和zmg2基因的水稻其单株产量分别较野生型提高16-25％和约33％以上，小区产量的结果也与之类似，转zmglk1和zmg2基因的水稻在北京可增产13-15％和28-32％，在海南增产14-18％和34-45％。说明在水稻中转入玉米基因zmglk1和zmg2后，可提高其抵御高光抑制的能力，从而大幅提高转基因水稻的生物量以及产量。地上部干重的测量方法如下：田间实验中每个水稻材料设3个小区重复，随机分布。水稻成熟后，单株秸秆去除籽粒后，装入尼龙网袋中于80℃烘干至恒重，对样品进行称重。每个水稻材料取20-30个单株重复用于统计分析。籽粒产量的测量方法如下：水稻单株稻穗脱粒并去除瘪粒后称重即为单株籽粒产量，每个水稻材料取20-30个单株重复用于统计分析。统计小区产量时去除边行，取中间的30株水稻测定籽粒重量计为一个小区产量，3个小区重复用于统计分析。各指标的结果如表2和图5所示。表2、转基因植株的地上部干重及籽粒产量的测量结果表2中，glk1-2、glk1-3、g2-2和g2-3分别为zmubipro:zmglk1-2和zmubipro:zmglk1-3、zmubipro:zmg2-2和zmubipro:zmg2-3。**表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.01)，*表示与野生型水稻相比，差异达到显著水平(p＜0.05)。<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>zmg2在提高植物强光胁迫抗性和产量中的应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>476<212>prt<213>玉米（zeamaysl.）<400>1metleualavalserproserprovalargcysalaaspalagluglu151015cysglyglyglyglyalaserlysglumetglugluthralavalgly202530provalseraspseraspleuasppheaspphethrvalaspaspile354045asppheglyaspphepheleuargleuaspaspglyaspaspalaleu505560proglyleugluvalaspproalagluilevalphealaasppheglu65707580alailealathralaglyglyaspglyglyvalthraspglngluval859095proservalleuprophealaaspalaalahisileglyalavalasp100105110procyscysglyvalleuglygluaspasnaspalaalacysalaasp115120125valglugluglylysglyglucysasphisalaaspgluvalalaala130135140alaglyasnasnasnseraspserglyglualaglycysglyglyala145150155160phealaglyglulysserproserserthralaserserserglnglu165170175alagluserargarglysvalserlyslyshisserglnglylyslys180185190lysalalysvalasptrpthrprogluleuhisargargphevalgln195200205alavalglugluleuglyileasplysalava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