植物乳杆菌代谢FOS的局部调控蛋白及其调控方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对植物乳杆菌代谢fos起局部调控作用的转录蛋白sacr2(局部调控蛋白)。

背景技术：

低聚果糖(fructooligosaccharides，fos)是指2-10个果糖基为链节，以β(2-1)或β(2-6)糖苷键连接形成的碳水化合物。除具有一般低聚糖的理化性质外，fos作为一种常用的益生元，其最引人注目的生理特性是能明显改善肠道内微生物的种群比例。因而，fos作为能够实现人体微生态平衡的优秀配料，已被广泛地应用于食品工业中。近年来，随着各种高通量测序技术的应用特别是系统生物学技术的完善，转录组学技术和表达谱芯片技术分别用来解析乳酸菌糖代谢过程中的变化。

转录调控系统由转录因子、靶基因及其启动子区域内的结合位点等调控元件构成，转录因子通过与结合位点的特异性结合，可以激活或抑制下游靶基因的转录表达。近年来，科学家们对乳酸菌糖代谢过程中的转录调控机制做了大量的研究工作，认为乳酸菌的糖代谢过程常常会受到全局调控和局部调控的双重效应。全局调控通常由一种易被宿主所利用的糖(如葡萄糖)所诱导的代谢控制蛋白a(catabolitecontrolproteina，ccpa)与代谢反应元件(cataboliteresponseelement，cre)的结合来完成，ccpa与位于启动子区域或其下游的cre位点相结合而阻止该结构基因的转录。局部调控是局部转录因子(也成阻遏蛋白)在无诱导物存在时，与相应的结合位点结合使得结构基因不能正常转录；诱导物存在时，转录因子与之结合，转录因子从结合位点上脱离，rna结合酶启动结构基因的正常转录。

为了探索不同乳酸菌代谢fos的途径，在前期研究中以植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)为研究对象，研究发现一个大小为4.5kb(sacpts2基因簇)的基因簇参与到植物乳杆菌对fos的代谢过程(参考文献：chenchen,guozhongzhao,weichen,benhengguo.metabolismoffructooligosaccharidesinlactobacillusplantarumst-iiiviadifferentialgenetranscriptionandalterationofcellmembranefluidity.appliedandenvironmentalmicrobiology,2015,81(22):7697–7707)。fos是通过sacpts2的pts系统转运进胞内后，被胞内的果糖苷酶(saca)水解成单糖。在这个基因簇中发现一个基因sacr2编码galr-laci家族类型的转录因子，但是sacr2在植物乳杆菌代谢fos过程中发挥的作用及其调控机制仍不清楚。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种对乳酸菌代谢fos起局部调控作用的转录调控蛋白(即sacr2)及其大肠杆菌表达载体(pet28a-sacr2)，同时提供该载体的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是：

一种分离的核酸，其特征在于，其编码氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白质。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：

从自然界中提取天然存在的编码氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过基因克隆技术获得编码氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的蛋白质的核酸分子。

本发明中，所述的核酸优选地具有如序列表中seqidno:2所示的核苷酸序列，更优选地，所述核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno:2所示。

为在大肠杆菌宿主细菌中异源表达对分离的核苷酸序列进行优化，其中所述分离的核苷酸包括编码蛋白质的核苷酸序列；

将优化的核苷酸序列连接到表达载体中；

其中所述核苷酸的优化包括步骤：

通过用通常存在的密码子置换稀有密码子从核苷酸序列中鉴定和修饰在大肠杆菌宿主细菌中不常使用的稀有密码子；

从核苷酸序列中鉴定和修饰推测的内部核糖体结合位点序列；

通过消除五个或更多g核苷酸侧枝核酸序列中鉴定和修饰延伸的g或c核苷酸重复；

鉴定和最小化核苷酸序列的rbs和基因编码区中的mrna二级结构；

从该核苷酸序列中鉴定和修饰不希望存在的酶限制性位点，以形成优化的核苷酸序列。

如本领域技术人员所知：编码氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的蛋白质的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个碱基的方式来提供一个多聚核苷酸的同系物，只要该同系物编码的蛋白质依然能够保持氨基酸序列组成如序列表中seqidno:1所示的蛋白质的功能即可。

本发明提供的技术方案之二是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将上述核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，本发明所述载体更优选为质粒pet28a，即本发明所述的重组表达载体更优选为将上述核酸连接于质粒pet28a上构建而成。

优选地，所述的重组表达载体包括与上述核酸操作性连接的启动子区域。

优选地，所述的重组表达载体含有一段his6的序列。

本发明提供的技术方案之三是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规，如可以通过将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且使所携带的编码氨基酸序列组成如序列表中seqidno:1所示蛋白质的基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌dh5α。将前述重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规的转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明提供的技术方案之四是：

一种重组菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中seqidno:1所示蛋白质的外源基因。

优选地，所述的重组菌为重组乳酸菌。

更优选地，所述的乳酸菌为植物乳杆菌菌株。

本发明提供的技术方案之五是：

一种分离的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno:1所示；或为包含氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签的融合蛋白。

本发明所述的蛋白质是一种参与乳酸菌代谢fos的局部调控蛋白，名称为sacr2，来源于植物乳杆菌，其可以通过本领域常规的方法获得，如将编码所述蛋白质的基因导入合适的宿主细胞得到能够正常表达所述蛋白质的转化体，然后培养所述的转化体，从培养物中分离所述蛋白质即可。所述的蛋白质还可以通过人工全序列合成而得。

如本领域技术人员所知：所述蛋白质的氨基酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个氨基酸而得所述蛋白质的同系物，只要该蛋白质的同系物依然能够保持所述蛋白质的功能即可。

本发明中，所述的蛋白纯化标签为本领域常规所述，较佳地为his6纯化标签，即本发明所述的融合蛋白较佳地为由氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的蛋白质与his6纯化标签组成的融合蛋白。

本发明所提供的技术方案之五是：蛋白免疫印迹(westernblot)，一种鉴定重组蛋白表达产物的方法。

其中所述的鉴定重组蛋白表达产物的方法为本领域常规方法，即采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。若在凝胶上形成明显的条带则证明蛋白已表达。

本发明所提供的技术方案之六是：

上述的蛋白质在调控乳酸菌代谢fos中的应用，其特征在于，所述的蛋白质与fos相关基因启动子区域cre位点结合，以实现对fos代谢的局部调控。

本发明所提供的技术方案之七是：蛋白免疫印迹(westernblot)，一种鉴定重组蛋白表达产物的方法。

其中所述的鉴定重组蛋白表达产物的方法为本领域常规方法，即采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。若在凝胶上形成明显的条带则证明蛋白已表达。

本发明所提供的技术方案之八是：一种验证转录因子与相关基因启动子区域特异性结合的方法，即凝胶迁移实验(electrophoresismobilityshiftassay，emsa)。本发明通过emsa实验验证了调控蛋白sacr2与fos代谢相关基因的启动子区域结合位点的特异性结合。

利用特异性标记的dna探针与纯化的蛋白相结合，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上形成滞后带，从而验证转录因子与相关基因启动子区域的特异性结合。

其中所述验证转录因子与相关基因启动子区域特异性结合的方法为本领域常规方法，即纯化的dna特异结合蛋白(sacr2)和经标记的dna探针一同孵育，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离蛋白质-dna复合物和游离的探针，若在凝胶上形成滞后带则证明转录因子与启动子区域已结合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过emsa实验证明了局部调控蛋白sacr2与fos相关基因启动子区域的结合，为构建植物乳杆菌代谢fos的整体调控网络提供了理论依据与实验支持。本发明提供的对代谢fos起局部调控作用的转录调控蛋白sacr2为一种galr-laci家族的调控蛋白，这是首次发现该类蛋白参与植物乳杆菌代谢fos的调控。

附图说明

图1为中编号“1”的泳道为胶回收产物；编号“2”的泳道为puc57-sacr2经nhei和hindiii酶切后的电泳图；编号“3”的泳道为pet28a-sacr2经nhei和hindiii酶切后的电泳图；m1为dl2000marker；m2为dl10000marker；

图2为重组蛋白表达鉴定及纯化后的电泳结果图，其中，m为蛋白marker；编号“1”的泳道为e.colibl21-sacr2诱导前细胞的破碎上清；编号“2”的泳道为e.colibl21-sacr2诱导后的细胞破碎上清；编号“3”的泳道为目的蛋白经ni2+柱纯化后的电泳结果；

图3为表达载体pet28a-sacr2的构建示意图；

图4为westernblot的实验结果图，其中，m为蛋白marker；编号“1”的泳道为目的蛋白sacr2纯化后的电泳结果；

图5为验证2个启动子区域sacr2-dna结合的emsa实验结果图，其中，m为蛋白marker；编号“1-4”的泳道为his6-sacr2蛋白与被fam标记的启动子pagl4-sacr2混合后，凝胶电泳显示出有滞后的条带，即形成sacr2-dna复合物，并且随着his6-sacr2蛋白浓度的逐渐增加，滞后的条带颜色越来越深，说明sacr2-dna复合物结合强度越来越强；编号“5”的泳道为标记和未标记的dna探针混合在一起进行竞争性实验时，没有发现滞后带的形成。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1：目的核酸序列的密码子优化

对所需合成的序列进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列连接。根据基因序列分析的结果，分别进行引物单链oligo的设计及合成。利用pcr将合成的oligo拼接成完整的基因序列。将合成好的序列装入puc57载体并转化至感受态细胞dh5α(此部分由上海百力格生物技术有限公司完成)。

实施例2：重组表达质粒的构建

将上海百力格生物技术有限公司提供的puc57-sacr2质粒及表达质粒pet28a分别进行双酶切(nhei和hindiii)，酶切体系参照限制性内切酶说明书，回收纯化酶切产物。将纯化后的酶切产物进行连接，连接体系：2μl扩增产物(201.168ng/μl)、5μl酶切产物(载体)(216.451ng/μl)、1μlezmax重组酶、2μl5×buffer，反应条件：16℃、30min。采用热刺激转化法将连接反应液转化到加大肠杆菌bl21感受态细胞中，经37℃、180rpm、60min摇床振荡培养后，室温4000rpm离心5min，再涂布到含150μg/ml硫酸卡那抗性的lb培养基上，37℃培养24h。筛选阳性克隆并进行测序鉴定，得到正确的目标重组表达载体，将其命名为pet28a-sacr2，该重组表达载体包含一种核酸，其碱基序列如序列表中seqidno:2所示，该核酸编码一种分离的蛋白质，所述的分离的蛋白质为包含氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签his6的融合蛋白，相应的重组菌命名为bl21-sacr2。

结果分析：

将上海百力格生物有限公司提供的puc57-sacr2质粒与载体pet28a分别进行双酶切(nhei和hindiii)，回收纯化后酶切产物进行连接，构建表达载体pet28a-sacr2，表达载体构建示意图如图3所示。将重组质粒连接物转化至e.colibl21(de3)，37℃平板培养24h，挑选阳性转化子接种至lb液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，提取重组质粒，用对应的限制性内切酶对重组质粒进行鉴定。pet28a-sacr2经nhei和hindiii酶切，得到5kb左右的pet28a线性片段和1kb左右的目的基因片段，如图1编号“3”泳道所示，证明表达载体pet28a-sacr2成功转入大肠杆菌bl21(de3)宿主菌中。阳性表达宿主命名为bl21-sacr2。

实施例3：目的蛋白的诱导表达

挑取大肠杆菌bl21-sacr2单菌落于20ml含150μg/ml的硫酸卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，200rpm摇瓶培养过夜。将过夜培养菌液，接种至200ml含有150μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，接种量为2％，培养温度37℃，摇床振荡速率为200rpm，在od600nm达到0.4-0.6左右时，加入诱导剂iptg至终浓度为0.1mmol/l，分别在37℃3h、25℃6h、和16℃过夜振荡培养，根据sds-page蛋白胶电泳结果选择最佳的诱导条件，结果表明在25℃6h的培养条件下诱导效果最好。诱导完毕后，于4℃，10000g离心10min，收集菌体细胞。每克湿菌体细胞加入5ml结合缓冲液(0.2mpb，5mnacl，1m咪唑，ph7.4)重悬菌体细胞，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，和苯甲基磺酰氟(pmsf)至终浓度1mm，冰浴30min后，进行超声破碎。破碎条件如下：超声200w，超声2s，间歇2s，作用10min，整个过程于冰浴中进行。然后加rnase至终浓度10μg/ml和dnase至终浓度5μg/ml混匀，细胞破碎液于4℃，12000rpm/min离心10min，收集上清，即蛋白样品。

将10μl蛋白样品与6μl的6×上样缓冲液混合，于漩涡振荡器上振匀，电加热器100℃加热3min后，采用5％的浓缩胶和12％分离胶进行跑胶，电极缓冲液为ph8.3的tris-甘氨酸缓冲液。当样品处于浓缩胶时的电压设定为80v，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后改电压为120v；电泳完后，用考马斯亮蓝染色液于室温染色2h后，用脱色液脱色至蛋白条带清晰。染色与脱色过程中均在脱色摇床上完成。通过凝胶成像仪灰度扫描电泳胶板，分析蛋白分布与浓度。

结果分析：

大肠杆菌bl21-sacr2经iptg诱导后，菌体量明显增多，胞内上清在约42kda处有一条明显的重组蛋白表达条带，诱导蛋白的电泳结果如图2所示。

实施例4：蛋白纯化

将每克实施例2所得的湿菌体加入5ml细胞裂解缓冲液(0.2mpb，5mnacl，1m咪唑，ph7.4)重悬菌体细胞，加入溶菌酶至1mg/ml，和苯甲基磺酰氟(pmsf)至终浓度1mm，冰浴30min后，进行超声破碎。破碎条件如下：超声200w，超声2s，间歇2s，作用10min，整个过程于冰浴中进行。然后加rnase至10μg/ml和dnase至5μg/ml混匀，细胞破碎液于4℃，12000rpm/min离心10min，收集上清。将上清装入亲和层析柱后用10倍体积的结合缓冲液(0.2mpb，5mnacl，1m咪唑，ph7.4)洗去杂蛋白后，用不同浓度的洗脱缓冲液(0.2mpb，5mnacl和浓度分别为100mmol/l、200mmol/l、300mmol/l、400mmol/l、500mmol/l、600mmol/l的咪唑)梯度洗脱目标蛋白。取10μl洗脱蛋白液与6μl的6×上样缓冲液混合，用以进行蛋白电泳分析。

结果分析：

重组蛋白因带有his6标签可被特异性地吸附至亲和介质(ni²⁺)上从而与杂蛋白迅速分离。低浓度的咪唑能起到去除杂蛋白并纯化蛋白的作用，而与介质亲和力强的重组蛋白能在高浓度的咪唑作用下洗脱下来。由大肠杆菌bl21-sacr2表达的重组蛋白sacr2通过ni²⁺亲和色谱进行纯化，在结合缓冲液中添加终浓度1m咪唑，即可以去除大部分的杂蛋白，使得重组蛋白最大限度地吸附到填料上；之后采用梯度浓度洗脱目标蛋白，结果表明300mmol/l浓度的咪唑能完全洗脱亲和填料上的目标蛋白(即his6-sacr2蛋白)。

实施例5：重组蛋白表达产物的westernblot鉴定

配置12wt％的分离胶，加异丙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除异丙醇，再用水冲洗残余的异丙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5％的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子；安装好电泳装置，上样，120v，90min；转膜，湿转120v稳压转100min；封闭，将醋酸纤维膜放入5％的脱脂牛奶中，封闭30min；pbs洗膜3次，每次5min；孵育一抗(生工生物工程(上海)股份有限公司，d191001-0100)，4℃孵育过夜；pbs洗膜3次，每次10min；孵育二抗(上海翊圣生物科技有限公司，33208es60)，室温孵育2h；pbs洗膜3次，每次10min；按1：1的比例加入试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，d601017-0010)中的两种发光剂，孵育1min；用保鲜膜包起，放入曝光盒中，在暗室中将胶片放入曝光盒中进行曝光，曝光时间长短根据结果自行调控；显影、定影，扫描结果。

结果分析

westernblot实验结果(如图4)显示sacr2基因在42kda处有一条明显的蛋白质印迹带，由此说明sacr2在大肠杆菌中成功进行异源表达。

实施例6：emsa实验

在位于基因簇sacpts2中含2个潜在cre位点(seqidno：3-seqidno：4)的启动子区(pagl4-sacr2)设计引物(seqidno：5-seqidno：6)，进行pcr扩增，得到大小为200bp的pcr片段；按照实施例2的方法分别构建克隆表达载体，提取质粒。

(1)2.0％tbe丙烯酰胺凝胶的配置按照试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，c631100-0200)说明书进行。

(2)探针的标记：在位于基因簇sacpts2中含2个潜在cre位点的启动子区设计引物(seqidno：5-seqidno：6)，以植物乳杆菌基因组为模板，进行pcr反应。pcr反应体系为50μl，各反应物的量为：2μldna模板(13.174ng/μl)、2μl引物f(0.2μm)、2μl引物r(0.2μm)、25μl2xgoldstarbestmastermix，用ddh2o补足至50μl。pcr反应参数为：95℃预变性10min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min，4℃下保存，得到大小为200bp的pcr片段，将纯化后的扩增产物和t载体pmd19(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，连接体系：3μl扩增产物(127.951ng/μl)、2μlt载体pmd19(50ng/μl)、5μldnaligationkit<mightymix>，反应条件：16℃、30min。采用热刺激转化法将连接反应液转化到加大肠杆菌bl21感受态细胞中，经37℃、180rpm、60min摇床振荡培养后，室温4000rpm离心5min，再涂布到含150μg/ml硫酸卡那抗性的lb培养基上，37℃培养24h。筛选阳性克隆并进行测序鉴定，提取质粒；以得到的质粒为模板，采用高保真dpxdnaploymerase(购自吐露港生物科技有限公司)，以m13f-47(5’端含有fam探针修饰，seqidno：7)和m13r-48(seqidno：8)为引物进行pcr扩增。pcr反应体系为50μl，各反应物的量为：2μldna模板(13.174ng/μl)、2μlm13f-47(fam)(0.2μm)、2μlm13r-48(0.2μm)、25μldpxdnaploymerase，用ddh2o补足至50μl。pcr反应参数为：95℃预变性10min，94℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃下保存，得到含fam标记的探针pagl4-sacr；以得到的质粒为模板，构建未标记的探针pagl4-sacr：以m13f-47(seqidno：7)和m13r-48(seqidno：8)为引物进行pcr扩增。pcr反应体系为50μl，各反应物的量为：2μldna模板(13.174ng/μl)、2μlm13f-47(0.2μm)、2μlm13r-48(0.2μm)、25μldpxdnaploymerase，用ddh2o补足至50μl。pcr反应参数为：95℃预变性10min，94℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃下保存，得到未标记的探针。将得到的pcr产物，用pcrclean-upsystem试剂盒按照说明书步骤进行纯化，并用nanodrop2000c进行定量分析；

(3)反应体系：将50ng的被标记的dna探针、不同浓度(0、2、5、10、10μg)的实施例3所得的已纯化his6-sacr2蛋白和10μl结合缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0),100mmkcl,2.5mmmgcl2,0.2mmdtt,2μgpolydidcand10％glycerol)混合，用nuclease-freewater补足至20μl；30℃下孵育30min；

(4)电泳显影；用预冷的2.0％tbe丙烯酰胺凝胶作为电泳缓冲液，120v恒压预电泳30min；将蛋白-dna结合产物上样，继续低温电泳，150v，30min；电泳后的胶进行曝光显影。

结果分析：

为验证sacr2是否能够在体外与2个潜在的cre位点结合，用his6标记的sacr2蛋白在大肠杆菌中进行异源表达，用his6-sacr2蛋白进行emsa实验。结果如图5(泳道1-4)所示，his6-sacr2蛋白与被fam标记的启动子pagl4-sacr混合后，凝胶电泳显示出有滞后的条带，形成sacr2-dna复合物，并且随着his6-sacr2蛋白浓度的逐渐增加，滞后的条带颜色越来越深，说明sacr2-dna复合物结合强度越来越强。相反，当标记和未标记的dna探针混合在一起进行竞争性实验时(泳道5)，没有发现滞后带的形成，sacr2蛋白与dna探针的结合效应被竞争性抑制，证明了sacr2与这些启动子区域的特异性结合。

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<110>上海应用技术大学

<120>一种植物乳杆菌代谢fos的局部调控蛋白及其调控方式

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