一种Obovatol曼尼希碱类衍生物及其制备方法与应用与流程

本发明属于杀菌剂合成技术领域，具体涉及一种obovatol曼尼希碱类衍生物及其制备方法与应用。

背景技术：

obovatol是从木兰科植物日本厚朴(magnoliaobovatathunb)的树叶和树皮中提取分离得到的一种具有新颖联苯醚结构的木脂素类obovatol曼尼希碱类衍生物，obovatol的化学通式为因其具有广泛的生物学活性而成为近年来的研究热点。文献[choi,n.h.,choi,g.j.,min,b.s.,jang,k.s.,choi,y.h.,kang,m.s.,park,m.s.,choi,j.e.,bae,b.k.,kim,j.c.effectsofneolignansfromthestembarkofmagnoliaobovataonplantpathogenicfungi.j.app.microbiol.2009,106(6):2057-2063.]报道了obovatol对七种植物病原真菌的抑制作用。

由于obovatol属于多酚类物质，含有独立的邻苯二酚结构，此类结构在生物体内由于细胞组织和各种酶的保护作用能稳定存在，但是一旦离开活体组织，由于受自然界光照和空气氧化等作用，其结构将不易保持原有的稳定型。

现阶段，尽管已有文献报道了obovatol的抗菌作用，但却没有文献研究其衍生物或类似物的抗菌效果，更缺乏其抗菌构效关系及抗菌作用机制的研究，这也极大地制约了对此类化合物及其衍生物抗菌作用的深入研究。而且现阶段市场上更无含此类结构的杀菌剂，因而本发明以obovatol为先导化合物，通过结构修饰设计合成了系列曼尼希碱类衍生物，旨在筛选新型抗菌活性分子，为开发绿色植物源抗菌剂奠定基础，故此obovatol曼尼希碱类衍生物的合成及其在抗植物病原真菌方面的活性研究具有很强的新颖性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种obovatol曼尼希碱类衍生物及其制备方法与应用，本方法将不同的取代基团导入obovatol制备的obovatol曼尼希碱类衍生物，得到生物活性较高的新结构，制备的obovatol曼尼希碱类衍生物具有较高的杀菌活性，衍生物6、7和18对番茄早疫病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、6、7和8对腐皮镰刀病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、3、6、7、8、12、14、15、18和21对番茄灰霉病菌具有离体抑制活性；衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌具有离体抑制活性；衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌具有离体抑制活性；衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌具有离体抑制活性

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种obovatol曼尼希碱类衍生物，所述obovatol曼尼希碱类衍生物的具有如下化学通式所示的结构式：

所述结构式中r的结构式为以下结构式中的任一种:依次命名为衍生物1～衍生物21。

本发明还提供了上述的obovatol曼尼希碱类衍生物的方法，该方法为：

将obovatol溶于无水乙醇中，然后依次加入37％甲醛水溶液和二级胺，转入温度为40℃～60℃的油浴中，回流反应6h～24h，并用薄层色谱跟踪检测，当所述obovatol消失后，自然冷却至室温，减压浓缩，用硅胶薄层色谱分离，得到obovatol曼尼希碱类衍生物。

优选地，所述obovatol、二级胺、37％甲醛水溶液和无水乙醇的用量比为1mmol：3mmol：3mmol：5ml。

优选地，所述二级胺为二甲胺、二乙胺、吡咯烷、吗啉、硫代吗啉、1-甲基哌嗪、1-乙基哌嗪、1-(2-甲氧基乙基)哌嗪、1-乙酰基哌嗪、n-哌嗪甲酸乙酯、1-苯基哌嗪、1-(3-甲基苯基)哌嗪、1-(3-甲氧基苯基)哌嗪、2-甲基哌啶、3-甲基哌啶、4-甲基哌啶、3，5-二甲基哌啶、4-哌啶甲酸甲酯、3-哌啶甲酸乙酯、4-苯基哌啶或4-苄基哌啶。

本发明还提供了上述的obovatol曼尼希碱类衍生物的应用，所述obovatol曼尼希碱类衍生物中，衍生物6、7和18对番茄早疫病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、6、7和8对腐皮镰刀病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、3、6、7、8、12、14、15、18和21对番茄灰霉病菌具有离体抑制活性；衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌具有离体抑制活性；衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌具有离体抑制活性；衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌具有离体抑制活性。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明将不同的取代基团导入obovatol制备的obovatol曼尼希碱类衍生物，得到生物活性较高的新结构，制备的obovatol曼尼希碱类衍生物具有较高的杀菌活性，衍生物6、7和18对番茄早疫病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、6、7和8对腐皮镰刀病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、3、6、7、8、12、14、15、18和21对番茄灰霉病菌具有离体抑制活性；衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌具有离体抑制活性；衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌具有离体抑制活性；衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌具有离体抑制活性。

2、发明涉及的部分obovatol曼尼希碱类衍生物，相比于母体obovatol而言其抗菌活性有所提高，衍生物2和7对腐皮镰刀病菌以及衍生物2、7和14对番茄灰霉病菌的抑制孢子萌发活性均高于obovatol；衍生物6和7对番茄早疫病菌的菌丝生长离体抑制活性，衍生物1、4、6、7和8对腐皮镰刀病菌的菌丝生长离体抑制活性，衍生物1、3、5、6、7、8、10、12、13、14、15、18、20和21对番茄灰霉病菌的菌丝生长离体抑制活性，衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌的菌丝生长离体抑制活性，衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌的菌丝生长离体抑制活性以及衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌的菌丝生长离体抑制活性均优于obovatol。而其更大的作用在于可以弥补obovatol结构的不稳定性，通过曼尼希反应在obovatol的邻羟基位引入胺甲基化结构，有助于邻二酚结构中富电子密度的下降，在一定程度上可以改善obovaol的自然存在稳定型，增加其实际应用的潜力。同时，通过引入结构多样的取代基团可以制备类型丰富的衍生物，从而得到抗菌活性各异的化合物，进而丰富此类结构的抗菌谱。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明的实施例1制备的衍生物11的核磁共振氢谱谱图。

图2是本发明的实施例1制备的衍生物11的核磁共振碳谱谱图。

图3是本发明的实施例1制备的衍生物20的核磁共振氢谱谱图。

图4是本发明的实施例1制备的衍生物20的核磁共振碳谱谱图。

图5是本发明的实施例2的obovatol曼尼希碱类衍生物对四种植物病原真菌孢子的抑制萌发效果。

图6是本发明的实施例2的obovatol曼尼希碱类衍生物对六种植物病原真菌菌丝生长的抑制效果。

具体实施方式

实施例1

本实施例的obovatol曼尼希碱类衍生物，所述obovatol曼尼希碱类衍生物具有如下化学通式所示的结构式：

本实施例还提供了上述的obovatol曼尼希碱类衍生物的方法，该方法为：

将1mmol的obovatol溶于5ml无水乙醇中，然后依次加入3mmol的37％甲醛水溶液和3mmol的二级胺，转入温度为40℃～60℃的油浴中，回流反应6h～24h，并用薄层色谱跟踪检测，当所述obovatol消失后，自然冷却至室温，减压浓缩，用硅胶薄层色谱分离，得到obovatol曼尼希碱类衍生物。

在上述方法中二级胺采用不同的原料制备得到的obovatol曼尼希碱类衍生物的r不同，将制备得到的obovatol曼尼希碱类衍生物分别命名为衍生物1～衍生物21，制备的obovatol曼尼希碱类衍生物(衍生物1～衍生物21)的物理性质和核磁数据如表1～2所示，图1～4为衍生物11和衍生物20的核磁共振氢谱和碳谱谱图。

表1obovatol曼尼希碱类衍生物的物理性质

注：表中“/”表示无需测定。

表2obovatol曼尼希碱类衍生物的核磁及高分辨率质谱数据

实施例2

本实施例为实施例1制备得到的obovatol曼尼希碱类衍生物(衍生物1～衍生物21)的抗菌活性试验：

1、供试植物病原真菌：番茄早疫病菌(alternariasolani)、腐皮镰刀病菌(fusariumsolani)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、黄瓜炭疽病菌(colletotrichumorbiculare)、辣椒枯萎病菌(fusariumoxysporum)、苹果炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)，由山西农业大学农学院植物病理学实验室提供。所有供试菌种使用前于25℃±1℃下在pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上活化数次，待其恢复至正常活力后即可用于抗菌活性试验。

2、样品及试剂：

供试样品：

实施例1制备得到的obovatol曼尼希碱类衍生物(衍生物1～衍生物21)；

对照药剂：

obovatol、99％噁霉灵原药、98％苯醚甲环唑原药和98％多菌灵原药；

溶剂：

dmso(二甲基亚砜)(色谱纯)、丙酮(分析纯)，乳化剂为吐温-80(优级纯)。

3、抗菌活性方法：

a、采用抑制孢子萌发法：将活化好的供试植物病原真菌(番茄早疫病菌、腐皮镰刀病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌)于pda培养基上分别培养数天直至其产孢。而后将菌落轻轻刮下，无菌水冲洗3次，双层纱布过滤。最后用无菌水溶液调节孢子悬浮液的浓度至100倍显微镜下每个视野约30～40个孢子，即制成待试验使用的孢子悬浮液。所有供试样品用dmso溶解后，用0.1％吐温-80无菌水溶液稀释至适宜浓度(最终有机溶剂含量不超过2％，v/v)。将等体积的孢子悬浮液和配制好的药液充分混匀后取30μl混合液滴加于凹玻片的小凹槽内，每个药剂处理重复3次，设置不含药剂的空白对照试验。将凹玻片置于有浅水层的培养皿中在适宜温度下培养一定时间，待对空白照组的孢子萌发率达到90％以上时，显微镜下观察，并按照公式-1计算各药剂处理组的孢子萌发率，并根据公式-2计算相应的校正孢子萌发抑制率，同时采用spss统计分析软件求出各药剂对不同病原菌孢子萌发的抑制中浓度(ic50)、标准偏差(sd)以及相应的95％置信区间(95％ci)等。测定结果见图5(图5中“/”表示未测定)。辣椒枯萎病菌和苹果炭疽病菌的孢子萌发条件较为苛刻，不太适宜采用抑制孢子萌发法测定其抗菌活性；

孢子萌发率＝萌发孢子数/统计孢子总数×100％(公式-1)

校正孢子萌发抑制率＝(对照组平均孢子萌发率-处理组平均孢子萌发率)/对照组平均孢子萌发率×100％(公式-2)

由图5可知，在抑制孢子萌发试验中，衍生物7和衍生物18对番茄早疫病菌孢子、衍生物2和衍生物7对腐皮镰刀菌以及衍生物2、衍生物7和衍生物14对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率均超过了两种阳性对照药剂(99％噁霉灵原药和98％苯醚甲环唑原药)，丰富此类抗菌结构，为进一步设计筛选高效抗菌结构奠定基础，故有望用于制备成高效、低毒的新型植物源孢子萌发抑制剂。通过对obovatol的结构改造得到高抗菌活性的衍生物。

本实施例涉及的obovatol曼尼希碱类衍生物，丰富了抗菌结构，因其母体结构源自植物次生代谢产物，经历了植物长期进化的过程，故其环境兼容性较好，生物活性较高，而且与化学抗菌剂相比，其可能具备低残留、易降解等特性，对环境友好。

b、采用菌丝生长速率测定法：将所有供试样品用丙酮溶解后同融化的pda培养基混匀，倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，制成浓度为100μg/ml的含药培养基(含药培养基中丙酮的含量不超过0.5％，v/v)。待培养基冷却凝固后，将事先活化好的供试菌种沿菌落边缘打制成直径为4mm的菌饼，接种于含药培养基的正中央，每个药剂重复3次，同时设置不含药剂的空白对照试验。适宜温度下培养至空白对照组菌落直径达到培养皿直径的2/3时为止，采用十字交叉法测量各处理组和对照组的菌落直径，计算各药剂处理组的菌丝生长抑制率，同时计算相应的标准偏差等。测定结果见图6。

菌丝生长抑制率＝(对照组平均菌落直径-处理组平均菌落直径)/(对照组平均菌落直径-4mm)×100％

由图6可知，抑制菌丝生长试验中，在100μg/ml的供试浓度下，衍生物6和7对番茄早疫病菌具有一定的抑制作用；衍生物1、6、7和8对腐皮镰刀病菌具有较高的离体抑制活性；衍生物1、3、6、7、8、12、14、15、18和21对番茄灰霉病菌具有较高的离体抑制活性；衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌具有较高的离体抑制活性；衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌具有较高的离体抑制活性；衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌具有较高的离体抑制活性。且某些obovatol曼尼希碱类衍生物的抑制率甚至接近或超过了两种阳性对照药剂(99％噁霉灵原药和98％多菌灵原药)，如：衍生物3、6和7对番茄灰霉病菌的菌丝生长抑制作用以及衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌的菌丝生长抑制作用均超过了两种阳性对照药剂。因而其有望用于制备新型高效植物源抗菌剂.

综上所示，通过抑制孢子萌发法和菌丝生长速率测定法可知，实施例1制备的obovatol曼尼希碱类衍生物中，衍生物6、7和18对番茄早疫病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、6、7和8对腐皮镰刀病菌具有离体抑制活性；衍生物1、2、3、6、7、8、12、14、15、18和21对番茄灰霉病菌具有离体抑制活性；衍生物1和14对黄瓜炭疽病菌具有离体抑制活性；衍生物6、8和14对辣椒枯萎病菌具有离体抑制活性；衍生物1、3、7和16对苹果炭疽病菌具有离体抑制活性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。