四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列及其筛选方法与流程

本发明涉及鳗弧菌的识别检测技术，具体涉及四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列及其筛选方法。
背景技术：
：（vibrioanguillarum）是一种革兰氏阴性菌，分布广泛，能感染鳗鱼、鲑科鱼类等50多种淡水、海水鱼类以及其他水产动物。.鳗弧菌一般聚集在宿主直肠上皮，进而进入宿主淋巴系统和血液，造成水产养殖动物感染疾病，出现肠道炎症、鳞片脱落、腹部肿胀、全身出血等表现，导致养殖业遭受严重的损失。因此，对鳗弧菌进行准确快速的检测鉴定是十分必要的，也是治疗和预防鳗弧菌相关疾病的前提和关键。指数富集配体进化技术（systemicevolutionofligandsbyexponentialenrichment），简称selex技术，是一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。因此，运用selex技术筛选鳗弧菌的核酸适配体，并将其应用于鳗弧菌的识别鉴定，将能大大提高鳗弧菌的检测灵敏度和特异性，提高其检测效率和准确性。selex技术流程如下：（1）先合成一个两端有固定序列、中间为随机序列的随机寡核苷酸文库，其中的两端固定序列可以与引物结合进行pcr扩增；（2）随机文库与靶目标在一定条件下结合一段时间；（3）分离出与靶目标结合的寡核苷酸；（4）对能与靶目标结合的寡核苷酸进行pcr扩增，获得可用于下一轮筛选的寡核苷酸文库，并测定该文库对靶目标的亲和力；（5）将第（4）获得的寡核苷酸文库再与靶目标进行结合，重复（2）至（4）的过程，直到亲和力不再增加或亲和力达到所需的水平，获得能与靶目标有较高亲和力的核酸适配体富集库；（6）对最后筛选出的核酸适配体富集库进行克隆测序；（7）从测序结果中挑选部分序列进行亲和特异性验证，亲和特异性较好的寡合苷酸序列就是筛选获得的核酸适配体。该技术在筛选过程需要进行多轮（一般都要10轮以上）的结合、分离、pcr扩增和亲和力的测定，不仅繁琐、劳动强度大，而且由于环节多、效率低，很容易导致筛选失败。现有鳗弧菌核酸适配体筛选过程中使用的随机寡核苷酸文库的中间序列通常超过50个碱基，碱基越长，不仅文库的合成成本越高，而且其形成的复杂空间结构的可能性也越大，空间结构复杂，越容易受各种因素的影响，包括在筛选过程中不断的分离、扩增、循环筛选等过程都很容易引起其结构变化，从而降低了筛选的效果和筛选的稳定性。同时，核酸适配体序列越长，造成其空间结构变化的可能性越高，结构也越不稳定。另外，序列越长，其有效结合靶标的位点效率越低。因此，获得更短序列的核酸适配体，是众多研究者所追求的，一些人甚至对已有的一些核酸适配体进行截短加工，但效果大多并不理想。当然，更短序列的核酸适配体也更难筛选，因为筛选中采用的随机文库越短，库容量就越小，即文库中各种各样不同空间结构的序列就越少，其中能与靶目标结合的序列也越少，因此在第一轮筛选中能与靶目标结合的适配体序列也越少，后续通过pcr对这些序列进行富集的难度也越大。第一轮筛选甚至可能会出现能结合的适配体太少，导致pcr扩增不出来的情况，导致筛选失败。另外，现有鳗弧菌适配体筛选中，几乎每轮都要进行亲和力的测定，每轮pcr的模板都要纯化后才进行pcr，每轮pcr产物也要经过纯化后才能作为筛选文库用于下一轮的筛选，这些亲和力测定和纯化的环节，大大增加了筛选的工作量，增加了筛选的环节和劳动强度，极大影响了筛选的效率。因此，有必要对现有鳗弧菌核酸适配体的筛选技术进行改进，开发一种随机文库较短、筛选工序更简化、效率更高、更能节省人力与物力的鳗弧菌核酸适配体的筛选技术，以获得中间序列较短、总序列较短的鳗弧菌核酸适配体。技术实现要素：针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了较短的四组用于鳗弧菌识别检测的寡核苷酸序列，即鳗弧菌的核酸适配体，及其筛选方法，该筛选技术达到了同时缩短筛选文库以及筛选时间的目的。具体内容如下：四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列，每个寡核苷酸序列的两端为固定序列，中间序列按照5'-3'的顺序排列如下：第一组包含两条序列：h1：tgctcctactgaccaccccggcth21：cttccccctgttctggccctgca第二组包含五条序列，分别为：h5：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctgah6：tccttcttgtgctccctcttgtgcagcctgah26：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcatgah38：tccctcttgtgctccttcttgtgcagcctgah33：ttcctcttgtgctccctcttgtgcagcctga；第三组包含三条序列，分别为：h12：tccctctggggtctccctcttgtgcagcctgah25：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctgagh42：tccctcttgtgctccctcttgtgcagccttga第四组包含一条序列，为：h28：ctccctcttgtgctccctcttgtgccttccccctgttctggccctgca所述的每组中的任意一条寡核苷酸序列的应用在于：作为核酸适配体的中间序列用于鳗弧菌的识别鉴定。进一步的，所述两端固定序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc--中间序列--gcacaagagggagaccccagaggg-3'。四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列的筛选方法，所述筛选方法基于selex筛选技术的改进，具体如下：（1）合成随机寡核苷酸文库：设计两端为固定序列，中间为35个随机碱基序列的寡核苷酸文库；（2）结合：随机文库与靶目标在一定条件下结合一段时间；（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；（4）pcr扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行pcr扩增，获得可用于下一轮筛选的寡核苷酸文库，所述文库一部分用于后续步骤（5）的高通量测序，一部分用于步骤（6）的重复循环筛选；（5）高通量测序：对pcr扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现频率大于或等于2次的寡核苷酸序列，即多拷贝序列作为候选序列，获得第一轮selex筛选的候选序列。（6）重复循环筛选：选取步骤（4）扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标在一定条件下结合，重复步骤（2）-（6），即结合、分离、pcr扩增、高通量测序、序列分析等步骤，获得第2轮筛选的候选序列；重复循环n次，获得n轮筛选的的候选序列；（7）序列分析：从第2轮开始，对步骤（6）筛选获得的1，2……n轮的候选序列进行比对分析，对所有重复的序列出现的频率进行统计；（8）亲和特异性验证：根据步骤（7）序列分析挑选出的各频率序列进行合成，后与靶目标及其它对照菌结合进行亲和特异性的验证，根据亲和特异性效果筛选出所需寡核苷酸序列，即核酸适配体。进一步的，步骤（1）所述随机文库序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc--n35--gcacaagagggagaccccagaggg-3'，步骤（4）所述的pcr的引物包括引物p1与p2，p1序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc-3'，p2序列为：5'-ccctctggggtctccctcttgtgc-3'。进一步的，所述靶目标为鳗弧菌。进一步的，步骤（6）所述的n≥2。进一步的，步骤（6）所述的n为3~5。进一步的，步骤（8）所述的亲和特异性验证采用超微量紫外可见分光光度计测定能与鳗弧菌结合的ssdna浓度，用ssdna浓度来表征亲和力。进一步的，所述的其他菌为哈维氏弧菌、溶藻弧菌或嗜水气单胞菌。本发明的有益效果在于：（1）筛选文库更短以及核酸适配体的序列更短。在缩短序列的情况下，更短的序列减少了识别检测中潜在的干扰因素，提高检测中的稳定性和可靠性。本发明不采用亲和力来判断筛选效果，而是采用每轮测序来判断，因此只要有稍微的富集出现，甚至这种富集还没达到亲和力的明显差异时，就可结束筛选。通过较短的随机文库以及高通量测序的方法，缩短了筛选的环节和筛选轮数，减少了筛选的工作量，提高了筛选效率，并最终得到较短序列的核酸适配体。（2）pcr扩增所需的模板以及pcr扩增的产物均不需要纯化。直接用筛选产物为模板进行pcr扩增，获得的pcr产物也无需纯化，可直接作为筛选文库用于下一轮的筛选。纯化过程易导致可能的适配体丢失，同时可能影响适配体的空间结构，进而影响后续pcr效果。本发明省略了每次pcr扩增中的两轮纯化，大大降低纯化占用的时间、精力和费用，也规避了适配体序列丢失或空间结构被破坏的风险。（3）提高筛选效率、减少筛选环节、缩短筛选时间。传统的selex筛选步骤，要进行10轮以上的筛选，且每轮筛选都要进行亲和力测定，以跟踪筛选的效果。本发明对每一轮筛选产物都进行高通量测序，并进行序列分析，利用多拷贝序列出现的频率和占比，提前从中找出潜在的高亲和特异性的候选适配体。省去了每一轮的亲和力测定，只需2-5轮的筛选提前获得潜在的高亲和特异性的候选适配体，大大提高了selex筛选的效率。另外省去了每轮pcr模板和产物的纯化，缩短了筛选工艺与时间，减少纯化导致变性或污染的风险。附图说明图1为h1序列的亲和特异性图；图2为h5序列的亲和特异性图；图3为h6序列的亲和特异性图；图4为h12序列的亲和特异性图；图5为h21序列的亲和特异性图；图6为h25序列的亲和特异性图；图7为h26序列的亲和特异性图；图8为h28序列的亲和特异性图；图9为h33序列的亲和特异性图；图10为h38序列的亲和特异性图；图11为h42序列的亲和特异性图。具体实施方式为了充分公开本发明，以下结合实施例加以说明。四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列，每个寡核苷酸序列的两端为固定序列，中间序列按照5'-3'的顺序排列如下：第一组包含两条序列：h1：tgctcctactgaccaccccggcth21：cttccccctgttctggccctgca第二组包含五条序列，分别为：h5：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctgah6：tccttcttgtgctccctcttgtgcagcctgah26：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcatgah38：tccctcttgtgctccttcttgtgcagcctgah33：ttcctcttgtgctccctcttgtgcagcctga；第三组包含三条序列，分别为：h12：tccctctggggtctccctcttgtgcagcctgah25：tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctgagh42：tccctcttgtgctccctcttgtgcagccttga第四组包含一条序列，为：h28：ctccctcttgtgctccctcttgtgccttccccctgttctggccctgca所述的每组中的任意一条寡核苷酸序列的应用在于：作为核酸适配体的中间序列用于鳗弧菌的检测。本发明的序列长度有：分组名称长度（nt）1h1,h21232h5,h6,h26,h38,h33313h12,h25,h42324h2848由上表可见，本发明的序列长度均不超过50，在缩短序列的情况下，不降低亲和力，缩短的序列减少了识别检测中潜在的干扰因素，提高检测中的稳定性和可靠性。检测效果或亲和力是取决于序列形成的空间结构，同样类似的空间结构既可以由短序列形成，也可以由长序列形成。但长序列的空间结构要相对更复杂，短序列的空间结构相对简单，而复杂的空间结构则更容易受外界干扰因素的影响。复杂结构中存在较多的子结构，与靶目标结合的位点可能只是其中的一个子结构，但其它子结构的变化都可能会影响这个与靶目标结合的这个子结构，进而影响其亲和力和检测效果。越复杂的结构，子结构也越多，受到干扰和影响的因素也越多。因此，通常获得了适配体序列后，还需要通过各种方法截短，目的是减少不必要的子结构，在保证亲和力的前提下获得更短的适配体序列，但截短后的亲和特异性大多并不好，亲和力取决于序列的空间结构，截短后空间结构会发生变化，进而影响其亲和力。进一步的，两端固定序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc--中间序列--gcacaagagggagaccccagaggg-3'。两端固定序列取决于筛选所用引物，引物不同，两端固定序列即不同。本发明筛选方法是基于selex筛选技术的改进，具体如下：（1）合成随机寡核苷酸文库：设计两端为固定序列，随机文库序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc--n35--gcacaagagggagaccccagaggg-3'，中间为35个随机碱基序列的寡核苷酸文库；两端固定序列可随引物改变而改变。筛选中采用的随机文库越短，它的库容量就越小，即文库中各种各样不同空间结构的序列就越少，而其中能与靶目标结合的序列也越少，因此在第一轮筛选中能与靶目标结合的适配体序列也越少，后续通过pcr对这些序列进行富集的难度也越大。第一轮筛选甚至可能会出现能结合的适配体太少，导致pcr扩增不出的情况，导致筛选失败。而较长序列的随机文库，其文库的库容量较大，文库中序列的多样性较高，能与靶目标结合的序列也较多，第一轮筛选中能与靶目标结合的适配体序列也越多，较易得到结果。因此，相比长序列的随机文库而言，采用短序列的随机文库进行selex筛选的筛选难度更大。另外，长序列的空间结构要相对更复杂，短序列的空间结构相对简单，而复杂的空间结构则更容易受外界干扰因素的影响。复杂结构中存在较多的子结构，与靶目标结合的位点可能只是其中的一个子结构，但其它子结构的变化都可能会影响这个与靶目标结合的这个子结构，进而影响其亲和力和检测效果。越复杂的结构，子结构也越多，受到干扰和影响的因素也越多。（2）结合：随机文库与靶目标在一定条件下结合一段时间；（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；（4）pcr扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行pcr扩增，获得pcr产物即可用于下一轮筛选的寡核苷酸文库，所述文库一部分用于后续步骤（5）的高通量测序，一部分用于步骤（6）的重复循环筛选；pcr的引物包括引物p1与p2，p1序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc-3'，p2序列为：5'-ccctctggggtctccctcttgtgc-3'。本发明的两条引物长度分别是23和24个碱基，引物序列较短且两条引物长度只相差一个碱基，引物长度影响pcr扩增的退火温度及反应时间等工序，两条引物的碱基长度若不相同或相差较大，将导致pcr扩增过程退火温度及时间无法平衡，会导致pcr扩增效率降低甚至pcr扩增失败。本发明引物总长度为47个碱基，属于较短引物。引物序列若过长，将增大最终筛选序列的长度。虽然增加引物长度能增加文库多样性，但筛选过程中引物与适配子的固定端的不能充分结合，即有效结合的碱基较少，pcr扩增会出现更多变异，降低扩增效率与效果。（5）高通量测序：对pcr扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现频率大于或等于2次的寡核苷酸序列，即多拷贝序列作为候选序列，获得第一轮selex筛选的候选序列。（6）重复循环筛选：选取步骤（4）扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标在一定条件下结合，重复步骤（2）-（6），即结合、分离、pcr扩增、高通量测序、序列分析等步骤，获得第2轮筛选的候选序列；重复循环n次，获得n轮筛选的的候选序列；优选的，n为3~5之间的整数。现有技术的selex技术，至少筛选到第10轮后用最后一轮的pcr产物去测序，每一轮pcr需要经过pcr模板与产物的分别纯化，以及每轮产物需进行亲和力测定，在工序上需花费更多的时间。本发明只通常只需要3~5轮筛选，且不需要纯化，也不需要进行每轮产物的亲和力测定，在该部分缩短了至少一半以上的筛选时间。现有的selex技术的最后筛选结果需要做高通量测序或普通测序，本发明增加了每轮产物的高通量测序，由于高通量测序能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，故本发明并不增加测序时间。相对来说，现有技术的纯化及亲和力测定依赖人工操作，高通量测序依赖设备，减少了人为因素的干扰。（7）序列分析：从第2轮开始，对步骤（6）筛选获得的1，2……n轮的候选序列进行比对分析，对所有重复的序列出现的频率进行统计；（8）亲和特异性验证：根据步骤（7）序列分析挑选出的各频率序列进行合成，然后与鳗弧菌以及其它对照菌（如哈维氏弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌等）结合进行亲和特异性的验证，用超微量紫外可见分光光度计测定能与上述这些菌结合的ssdna浓度，用ssdna浓度来表征亲和力。根据亲和特异性效果筛选出对鳗弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列，即为鳗弧菌的核酸适配体。本发明筛选过程是不需要测定亲和力的，最后的亲和特异性验证直接合成没有标记的候选序列，采用超微量紫外可见分光光度计来测定能与鳗弧菌结合的ssdna浓度，用ssdna浓度来表征亲和力。选用紫外可见光法在于其稳定性要高于荧光法。本发明采用了序列长度更短的文库进行筛选，由于越短文库中能与靶目标结合的序列较少，pcr的富集难度也较高，同样条件下需要更多轮的富集即更多轮的筛选才能达到相同的富集效。本发明不采用亲和力来判断筛选效果，而是采用每轮测序来判断，因此只要有稍微的富集出现，甚至这种富集还没达到亲和力的明显差异时，就可结束筛选。通过高通量测序缩短文库同时缩短筛选时间，最终得到较短序列的核酸适配体。实施例1申请人根据上述筛选方法，随机合成了两端固定序列为5'-tcagtcgcttcgccgtctccttc--中间序列--gcacaagagggagaccccagaggg-3'，中间序列为35个碱基长度的文库，进行了重复了5轮筛选，即n=5，通过对比高通量测序结果，获得了出现频率较高的序列，结果如下：申请人依据不同的序列长度划分了四个组别。为了验证本发明所得序列的亲和力效果，申请人分别以本发明所得寡核苷酸序列，按如下步骤做亲和力测试：1、核酸适配体的处理用0.5ml规格的离心管配制100μl的核酸适配体溶液，先取96μl的2×结合缓冲溶液（0.1mnacl,5mmkcl,50mmtris-hcl,1mmmgcl2,ph7.4）加入到0.5ml规格的离心管之后，再取4μl适配体溶液加入同一离心管中。之后放入恒温金属浴中，95℃加热变性5分钟，再放入冰浴中10分钟后取出，然后自然恢复至室温。2、细菌与核酸适配体的结合选择目标菌鳗弧菌和非目标菌溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌等六种菌，每种菌设置3个对照组和3个实验组，对照组为未加核酸适配体的菌液，实验组为加了核酸适配体的相同浓度的菌液，分别用超微量紫外可见分光光度计测定两组菌液中ssdna的浓度，核酸适配体的ssdna浓度可视为对相应菌的亲和力，即亲和力=实验组的ssdna浓度—对照组的ssdna浓度。对照组细菌溶液的配制：将100μl浓度为1x108个/ml细菌溶液与100μl的2×结合缓冲溶液混合均匀，做3个平行；实验组细菌溶液的配制：将100μl浓度为1x108个/ml细菌溶液与100μl变性好的核酸适配体溶液混合均匀，同样做3个平行；将对照组和实验组都放入温度在30℃，转速为100rpm的恒温空气浴摇床中，结合30分钟，然后将其全部取出，6000rpm离心5分钟后，用移液枪吸除离心管中的上清液，以除去未与细菌结合的核酸适配体，应尽可能的将除沉淀之外的液体完全吸除。完全吸除上清液之后，用200μl的1×结合缓冲溶液（用前面2×结合缓冲溶液稀释一倍）洗涤菌沉淀，然后以10000rpm，离心5分钟，吸去上清，重复以上洗涤操作3次，以去除没有和菌结合的核酸适配体。在最后一次的洗涤、离心结束后，用100μl的1×结合缓冲溶液悬浮菌沉淀后，用恒温金属浴在95℃温度条件下加热5分钟后，以让适配体变性分离到溶液中，然后趁热以15000rpm离心10分钟后，取上清。用超微量紫外可见分光光度计测定其中的ssdna的浓度。3、亲和力测定分别取实验组和对照组上清液1μl-2μl，用k5500超微量紫外可见分光光度计测定上清液中ssdna的含量，实验组的ssdna浓度值=菌的背景值+与菌结合的适配体的ssdna浓度，对照组中的ssdna浓度=菌的背景值，因此，该适配体对相应菌的亲和力=该菌结合的核酸适配体的ssdna浓度=实验组的ssdna浓度—对照组的ssdna浓度。因此，将实验组ssdna含量值减去对照组的ssdna含量，即为为该菌与适配体的亲和力。用上述方法可分别测定出相应适配体对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌等多种菌的亲和力。4、统计分析对上述获得的适配体与各种菌的亲和力数据进行统计分析。所有测得的实验数据均重复6次以上。并用t-检验对实验数据进行组间差异分析，p<0.05为显著性差异，p<0.01为极显著性差异。绘制得附图1-11亲和特异性结果。图中显示h1、h5、h6、h12、h21、h25、h26、h28、h33、h38、h42的11条序列对鳗弧菌均有较好亲和力，而对迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌及大肠杆菌的亲和力较弱，说明对鳗弧菌有较好的特异性，适宜作为鳗弧菌的核酸适配体。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本
技术领域：
的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。序列表<110>集美大学<120>四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列及其筛选方法<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>适配子h１()<400>1tgctcctactgaccaccccggct23<210>12<211>23<212>dna<213>适配子２１()<400>12cttccccctgttctggccctgca23<210>13<211>31<212>dna<213>适配子ｈ５()<400>13tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctga31<210>14<211>31<212>dna<213>适配子ｈ６()<400>14tccttcttgtgctccctcttgtgcagcctga31<210>15<211>31<212>dna<213>适配子ｈ２６()<400>15tccctcttgtgctccctcttgtgcagcatga31<210>16<211>31<212>dna<213>适配子ｈ３８()<400>16tccctcttgtgctccttcttgtgcagcctga31<210>12<211>31<212>dna<213>适配子ｈ３３()<400>12ttcctcttgtgctccctcttgtgcagcctga31<210>17<211>32<212>dna<213>适配子h12()<400>17tccctctggggtctccctcttgtgcagcctga32<210>18<211>32<212>dna<213>适配子h２５()<400>18tccctcttgtgctccctcttgtgcagcctgag32<210>19<211>32<212>dna<213>适配子h４２()<400>19tccctcttgtgctccctcttgtgcagccttga32<210>20<211>48<212>dna<213>适配子h２８()<400>20ctccctcttgtgctccctcttgtgccttccccctgttctggccctgca48<210>13<211>82<212>dna<213>随机文库()<400>13tcagtcgcttcgccgtctccttcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngc60acaagagggagaccccagaggg82<210>13<211>23<212>dna<213>引物ｐ１()<400>13tcagtcgcttcgccgtctccttc23<210>14<211>24<212>dna<213>引物ｐ２()<400>14ccctctggggtctccctcttgtgc24当前第1页12