一种血液病原体灭活效果质量控制方法与流程

本发明属于血液病原体灭活技术领域，具体涉及一种血液病原体灭活效果质量控制新方法。

背景技术：

目前用于血液病原体灭活效果验证的“金标准”是病毒滴度的检测。包括细胞病变法或噬斑法。细胞病变法，即组织半数感染量(tcicd50)测定，技术方案包括准备细胞、稀释待测病毒液、接种、培养、测定结果；

噬斑滴定法，将病毒样品在冰浴中用病毒维持液做10倍系列稀释，取10^-1到10^-66个稀释度各0.2ml分别接种于12孔细胞培养板上的单层细胞内，每个稀释度平行接种2孔，并留一孔作为对照。37℃吸附1小时后每孔加入1％甲基纤维素覆盖物，继续在37℃孵育10天后用甲醛固定，吸出覆盖物，用1％的结晶紫染色30min，水冲洗自然风干后数空斑并计算病毒滴度。

可以看出，传统的病毒灭活效果验证方法操作繁琐，耗时很长。无法即时得知结果。另外，传统的验证方法需要向产品中添加指示病毒，可能存在潜在污染的风险，也是对血液资源的浪费。同时，操作中需要培养细胞和病毒。即要求建立单独的细胞培养实验室。同时，培养病毒具有潜在的生物危害风险，需在二级及以上的生物安全实验室中进行。其运行和维护的成本很高，这对于大多数基层血站来说是不可能实现的。而目前血站在进行灭活工艺时，没有任何的质量控制方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的病原体灭活效果检测的质控方法，该方法不用添加指示病毒，避免了二次污染的风险；该方法所用的试剂和设备为实验室常规配置，血站现有的实验室即可完成，成本低廉；该方法操作简便，1-2天即可得到结果，时效性得到了提高。

本发明采取的技术手段为：

一种血液病原体灭活效果质量控制方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：根据人线粒体dna的核酸序列设计了两对引物，分别可扩增163bp长的mtdna短片段和1856bp的长片段；

(2)分别在亚甲蓝病毒灭活前后提取血浆样品中的dna；

(3)以提取的血浆dna为模板，用步骤(1)中的引物分别对灭活前后血浆样品中的mtdna进行pcr扩增；

pcr扩增使用体系为：分别加入pcrmixbuffer35ul、100mm的dntp1ul、设计好的100mm上下游引物各0.25ul、40x的sybrgreen0.5ul、5u/ul的faststarttaq0.5ul及提取好的dna模板15ul，混匀后形成57.5ul的pcr反应体系。将混匀后的反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增。扩增条件为95℃孵育1min，然后进行45个循环的95℃孵育30sec、60℃孵育30sec和72℃孵育45sec。

(4)使用扩增后1856bp片段的ct值减去163bp片段的ct值，得到两种片段的差值即dcp值，通过dcp值的大小初步判断血浆样品是否经过灭活。

本发明提供的一种血液病原体灭活效果质量控制方法，可采用实验室常规的方法快速对血站的病毒灭活血浆或其他成分进行灭活质量的控制。

附图说明

图1为实施例的两种mtdna片段pcr扩展标准曲线；

图2为实施例经不同的亚甲蓝灭活处理后血浆中两种mtdna片段扩增结果；

图3为采用本发明方法对20份亚甲蓝灭活前后血浆样品dcp值分布图。

具体实施方式

结合实施例说明本发明的技术方案。

将富含mtdna的血液细胞10倍梯度稀释后加入到血浆中，提取mtdna，进行两种片段的扩增。根据ct值绘制标准曲线，如图1所示。

未处理、经白光照射、加入终浓度0.1um亚甲蓝及0.1um亚甲蓝+白光照射后血浆中两种mtdna片段的log值进行对比，变化如图2所示。

采用本发明上述的方法对20份亚甲蓝灭活前后血浆样品进行检测。

分别收集未灭活和经亚甲蓝灭活的血浆样品各20份，用本发明的方法检测其dcp值。经灭活处理后的样品其dcp值基本分布于7-10的区间，而未灭活的样品dcp值分布于0-7的区间，检测的结果如图3所示。

技术特征：

1.一种血液病原体灭活效果质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计：根据人线粒体dna的核酸序列设计了两对引物，分别可扩增163bp长的mtdna短片段和1856bp的长片段；

(2)分别在亚甲蓝病毒灭活前后提取血浆样品中的dna；

(3)以提取的血浆dna为模板，用步骤(1)中的引物分别对灭活前后血浆样品中的mtdna进行pcr扩增；

(4)使用扩增后1856bp片段的ct值减去163bp片段的ct值，得到两种片段的差值即dcp值，通过dcp值的大小初步判断血浆样品是否经过灭活。

2.根据权利要求1所述的一种血液病原体灭活效果质量控制方法，其特征在于，步骤(3)pcr扩增使用体系为分别加入pcrmixbuffer35ul、100mm的dntp1ul、设计好的100mm上下游引物各0.25ul、40x的sybrgreen0.5ul、5u/ul的faststarttaq0.5ul及提取好的dna模板15ul，混匀后形成57.5ul的pcr反应体系；将混匀后的反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增；扩增条件为95℃孵育1min，然后进行45个循环的95℃孵育30sec、60℃孵育30sec和72℃孵育45sec。

技术总结
本发明提供一种血液病原体灭活效果质量控制方法，(1)引物设计：根据人线粒体DNA的核酸序列设计了两对引物，分别可扩增163bp长的mtDNA短片段和1856bp的长片段；(2)分别在亚甲蓝病毒灭活前后提取血浆样品中的DNA；(3)以提取的血浆DNA为模板，用步骤(1)中的引物分别对灭活前后血浆样品中的mtDNA进行PCR扩增；(4)使用扩增后1856bp片段的ct值减去163bp片段的ct值，得到两种片段的差值即dCP值，通过dCP值的大小初步判断血浆样品是否经过灭活。发明提供的一种血液病原体灭活效果质量控制方法，可采用实验室常规的方法快速对血站的病毒灭活血浆或其他成分进行灭活质量的控制。

技术研发人员：杨春晖;曾沛斌;徐敏;李世林;李玉佳;段晓琼;叶海艳;陈利民
受保护的技术使用者：中国医学科学院输血研究所
技术研发日：2019.09.16
技术公布日：2019.12.10