基于插入位点基因组序列建立的鉴定玉米转化体MIR604基因型的方法与流程

本发明涉及转基因育种和转基因标准物质研制领域中原材料基因型的鉴定技术，尤其涉及mir604玉米转化体基因型鉴定的引物/探针设计及其应用。

背景技术：

随着生物技术产业的迅速发展，不断有新的转基因品种推出并产业化，同时为了对已产业化和田间试验阶段的转基因品种进行监管和标识，需研制转基因检测标准物质。在转基因品种培育过程中，经常需要通过杂交，将成熟转化体的性状转育到综合性状更加优良的品种中，在转育的过程中，需要对大量的后代单株进行筛选。对纯合转基因单株和杂合转基因单株进行转基因检测时，检测结果都呈阳性，不能准确鉴定出哪些是纯合单株，哪些是杂合单株。在实际生产中通常采用分离试验来鉴定，需要将单株的后代再种植一代，对后代单株再次进行pcr检测，统计pcr结果，分析转基因性状在后代中是否分离以及分离情况，进而判定亲本植株是纯合体还是杂合体。这种基因型鉴定方式不仅费时，而且费力。由于纯合单株和杂合单株的转基因含量不同，也可采用实时荧光定量pcr和数字pcr技术来对转基因单株的基因型进行鉴定，但荧光定量pcr的定量原理导致其在识别2倍的含量差异时，容易导致鉴定偏差，结果不可靠。而采用数字pcr进行基因型鉴定，无论试剂还是平台本身都非常昂贵，不适合大规模鉴定。

在转基因检测标准物质生产中，涉及原材料的基因型鉴定。转基因检测标准物质的一个重要量值是转基因含量，而转基因含量的确定与原材料的基因型密切相关。对于纯合单株或纯合种子，在dna水平上转基因含量为100％，而对于杂合单株或杂合种子，在dna水平上转基因含量为50％。为了保护知识产权，研发商在提供的用于研制标准物质的原材料通常是灭活的种子，对种子的基因型不能通过分离试验确定。而且标准物质原材料鉴定不仅要鉴定基因型还要进行单粒鉴定，确定种子的纯度。通过定量pcr技术，将大大推高标准物质生产的成本，而且工作量巨大。

在此背景下，我们通过分析转基因玉米mir604外源基因插入位点的基因组序列，设计了一个引物/探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604-qp，将该引物/探针组合与mir604转化体特异性检测引物/探针组合mir604f/mir604r/mir604p组合使用，在普通pcr平台或实时荧光pcr平台上可实现转基因玉米mir604纯合单株(纯合种子)、杂合单株(杂合种子)的快速、经济的定性检测，检测结果准确可靠，鉴定原理如图1所示。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决缺乏转基因玉米mir604纯合单株(纯合种子)、杂合单株(杂合种子)快速经济的鉴定方法问题，分析转基因玉米mir604外源基因插入位点两侧的玉米基因组序列和受体基因组的插入位点序列，根据转基因玉米mir604受体基因组的插入位点序列设计引物/探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604-qp，为转基因玉米mir604纯合单株(纯合种子)、杂合单株(杂合种子)的鉴定提供一种快速、经济、可靠的方法。

本发明一个方面提供了一种转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性普通pcr检测引物组合物：

mir604-qf5′—gacgccagatcacacatg—3′seqidno.1

mir604-qr5′—cacacctcgttgccaaag—3′seqidno.2。

本发明另一个方面提供了一种转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性实时荧光pcr检测引物和探针组合物：

mir604-qf5′—gacgccagatcacacatg—3′seqidno.1

mir604-qr5′—cacacctcgttgccaaag—3′seqidno.2

mir604-qp5′—cgtgccgatctcgcaccagca—3′seqidno.3。

本发明另一个方面提供了一种转基因玉米mir604基因型鉴定的普通pcr检测用组合物，其包括：

本发明所述的转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性普通pcr检测引物组合物，

mir604转化体第二引物对：

mir604-1f5′-tcgcgcgcggtgtcatctatg-3′seqidno.4

mir604-1r5′-cgcgacacacctcgttagttaa-3′seqidno.5；以及

玉米内标基因zssiib引物对。

本发明另一个方面提供了一种转基因玉米mir604基因型鉴定的实时荧光pcr检测用组合物，其包括：

本发明所述的转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性检测引物和探针组合物，

mir604转化体第三引物对和第三探针组合物：

mir604-f5′-gcgcacgcaattcaacag-3′seqidno.6

mir604-r5′-ggtcataacgtgactcccttaattct-3′seqidno.7

mir604-p5′-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-3′seqidno.8；以及

玉米内标基因zssiib引物对和探针组合物。

在本发明的技术方案中，所述的玉米内标基因zssiib引物对为：

zssiib-f5′-cggtggatgctaaggctgatg-3′seqidno.9

zssiib-r5′-aaagggccaggttcattatcctc-3′seqidno.10，

在本发明的技术方案中，所述的玉米内标基因zssiib探针为：

zssiib-p5′-taaggagcactcgccgccgcatctg-3′seqidno.11。

本发明再一个方面提供了转基因玉米mir604受体基因组插入位点特异性检测方法，所述方法为普通pcr方法，其采用本发明所述的普通pcr检测用组合物进行检测，优选地：

通过分别以本发明所述的转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性检测引物组合物、mir604转化体第二引物对以及玉米内标基因zssiib引物对在普通pcr仪上扩增；

扩增结果中，玉米内标基因zssiib引物对和第二引物对扩增有条带的，判定为纯合体；3组引物对均有扩增产物，判定为杂合体；仅玉米内标基因zssiib引物对和受体基因组插入位点特异性检测引物组合物有扩增产物的，判定为阴性样品。

本发明再一个方面提供了转基因玉米mir604受体基因组插入位点特异性检测方法，所述方法为实时荧光pcr方法，其采用本发明所述的实时荧光pcr检测用组合物进行检测，优选地：

通过分别以本发明所述的转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性检测引物对和探针组合物、mir604转化体第三引物对和第三探针以及玉米内标基因zssiib引物对和探针组合物在实时荧光pcr仪上扩增；

扩增结果中，玉米内标基因zssiib引物对和探针组合物，和第三引物对和第三探针扩增有典型扩增曲线的，判定为纯合体；3组引物对均有典型扩增曲线的，判定为杂合体；仅玉米内标基因zssiib引物对和探针组合物，和受体基因组插入位点特异性检测引物组合物有典型扩增曲线的，判定为阴性样品。

本发明再一个方面提供了受体基因组插入位点特异性检测引物组合物在制备检测转基因玉米mir604试剂盒中的用途。

本发明再一个方面提供了转基因玉米mir604的受体基因组插入位点特异性检测引物和探针组合物在制备检测转基因玉米mir604试剂盒中的用途。

本发明再一个方面提供了转基因玉米mir604的普通pcr检测用组合物在制备检测转基因玉米mir604试剂盒中的用途。

本发明再一个方面提供了转基因玉米mir604的实时荧光pcr检测用组合物在制备检测转基因玉米mir604试剂盒中的用途。

在本发明的技术方案中，seqidno.12为玉米mir604在遗传转化过程中受体基因组插入位点缺失的核苷酸序列。seqidno.12如下：

gtgtcgtgccgatctcgcaccagcagcatcgcgtcctaaacaaaggaggtcctgtcctgcactgcactgcactgcacggatgcagctttggc。

在本发明的技术方案中，seqidno.13为玉米mir604受体基因组插入位点特异性pcr的扩增序列。seqidno.13如下：

gacgccagatcacacatggatgacgcggcacggcagctagccgagcaggcgctctgcgcacgcaagtgtcgtgccgatctcgcaccagcagcatcgcgtcctaaacaaaggaggtcctgtcctgcactgcactgcactgcacggatgcagctttggcaacgaggtgtg

本发明的目的是这样实现的：

一、引物/探针组合的设计

目前已经开发出了转基因玉米mir604的转化体特异性检测方法，可以特异性的识别样品中含有的mir604转化体成分，但仅用转化体特异性检测方法难以在定性pcr平台上实现mir604种子和单株的基因型鉴定。通过分析mir604纯合体和杂合体的分子特征，在外源基因插入位点的两侧分别设计一条引物mir604-qf/mir604-qr，在插入位点处缺失的核苷酸序列上设计一条探针mir604-qp，扩增产物跨过插入位点。对于mir604纯合体，其两条染色体上均有外源基因的插入，因此通过控制pcr延伸时间，仅mir604转化体特异性引物/探针组合mir604f/mir604r/mir604p有典型扩增曲线；对于mir604杂合体，一条染色体上有外源基因插入，一条染色体上无外源基因插入，两个引物探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604-qp和mir604f/mir604r/mir604p均有典型扩增曲线；对于阴性植株，则只有引物探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604-qp有典型扩增曲线。转基因玉米mir604纯合体、杂合体鉴定的原理示意图如图1所示。

本发明设计的引物探针序列如下：引物mir604-qf5′—gacgccagatcacacatg—3′(seqidno.1)、引物mir604-qr5′—cacacctcgttgccaaag—3′(seqidno.2)、探针mir604-qp5′—cgtgccgatctcgcaccagca—3′(seqidno.3)，扩增的靶标序列长168bp，如seqno.13所示。引物、探针在靶标序列上的位置如图2所示。

二、引物/探针组合的应用

合成本发明中的引物/探针、mir604转化体特异性引物/探针、玉米内标基因zssiib基因的引物探针。提取转基因玉米mir604样品总dna，分别利用内标准基因zssiib、mir604转化体和本发明中的引物对或引物/探针组合对样品基因组dna进行pcr扩增。普通pcr产物以琼脂糖凝胶电泳分离，eb染色后鉴定是否存在扩增产物；实时荧光pcr产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有扩增产物。根据各引物对或引物/探针组合的扩增结果，判断各样品的基因型。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

(1)在普通pcr或实时荧光pcr平台上，通过定性pcr准确判定待测样品的基因型；

(2)无需通过田间分离试验来鉴定纯合体或杂合体，节约了劳力、时间和经济成本；

(3)为转基因育种和转基因标准物质研制领域中原材料基因型的鉴定提供了一种准确、快捷、经济的方法。

附图说明

图1对转基因玉米mir604进行纯合体、杂合体鉴定的原理示意图；

图2设计的引物探针在靶标序列上的位置示意图；

图3采用普通定性pcr鉴定转基因玉米mir604纯合单株、杂合单株和阴性单株的电泳图谱。

图4采用实时荧光pcr鉴定转基因玉米mir604纯合单株、杂合单株和阴性单株的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明详细说明：

一、引物/探针组合的设计

(一)确定转基因玉米mir604插入位点处的玉米基因组序列

收集转基因玉米mir604中外源基因插入位点的两侧边界序列，将两侧的边界序列拼接到一起，与玉米的基因组序列进行比对分析，发现在外源基因插入玉米基因组的过程中导致玉米基因组在插入位点处缺失了92bp的核苷酸序列(seqno.2)。通过比对确定了mir604转化体插入位点处的玉米基因组序列。

(二)引物/探针组合的设计

利用引物设计软件primierprimer5软件在插入位点处两侧的玉米基因组序列上分别设计一条引物mir604-qf5′—gacgccagatcacacatg—3′seqidno.1和mir604-qr5′—cacacctcgttgccaaag—3′seqidno.2；利用beacondesign软件在缺失的核苷酸序列上设计一条探针mir604-qp5′—cgtgccgatctcgcaccagca—3′seqidno.3。扩增序列长160bp，引物探针在核苷酸序列上的位置如图2所示。

二、应用方法

(一)在普通pcr平台上鉴定转基因玉米mir604的基因型

用转基因玉米mir604的单株或单粒种子作为测试样品，利用本发明中设计的引物对mir604-qf/mir604-qr、mir604转化体引物对mir604-1f(5′-tcgcgcgcggtgtcatctatg-3′seqidno.4)/mir604-1r(5′-cgcgacacacctcgttagttaa-3′seqidno.5)、玉米内标基因zssiib引物对zssiib-f(5′-cggtggatgctaaggctgatg-3′seqidno.9)/zssiib-r(5′-aaagggccaggttcattatcctc-3′seqidno.10)，以提取的基因组dna为模板，对各样品进行纯合体、杂合体鉴定。

pcr反应采用25ul反应体系，含1μldna模板，1×pcrbuffer(含10mmtrishclph8.3，kcl50mm)，200umdntps，2.5mmmgcl2，250nm的正向引物和反向引物，1udnataq酶。反应程序为，94℃2分钟预变性，94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，35次循环，72℃保温2分钟。pcr产物以琼脂糖凝胶电泳分离，eb染色后鉴定是否存在扩增产物。

(二)在实时荧光pcr平台上鉴定转基因玉米mir604的基因型

用转基因玉米mir604的单株或单粒种子作为测试样品，利用本发明中设计的引物/探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604/qp、mir604转化体引物/探针组合mir604f(5′-gcgcacgcaattcaacag-3′seqidno.6)/mir604r(5′-ggtcataacgtgactcccttaattct-3′seqidno.7)/mir604p(5′-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-3′seqidno.8)、玉米内标基因zssiib的引物/探针组合zssiib-f(5′-cggtggatgctaaggctgatg-3′seqidno.9)/zssiib-r(5′-aaagggccaggttcattatcctc-3′seqidno.10)/zssiib-p(5′-taaggagcactcgccgccgcatctg-3′seqidno.11)，以提取的基因组dna为模板，对各样品进行纯合体、杂合体鉴定。

实时荧光pcr分析在一台cfx96pcr仪上进行，pcr反应体系20μl，含1μldna模板,1×pcrbuffer，1utaqdna聚合酶，4.5mmmgcl2,300μmdntps,200nm正向和反向引物,100nm探针。pcr反应程序：50℃2分钟和95℃10分钟预变性以后，进行50次pcr循环：95℃15秒变性，60℃1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

四、实验结果

(一)采用普通pcr法鉴定mir604玉米的基因型

用三个普通pcr引物对：本发明设计的引物对mir604-qf/mir604-qr、mir604转化体引物对mir604-1f/mir604-1r和玉米内标基因zssiib引物对zssiib-f/zssiib-r，扩增单株或单粒种子中提取的基因组dna。有的样品仅玉米内标基因zssiib和mir604转化体有扩增条带，判定为纯合体；有的样品3个引物对均有扩增产物，判定为杂合体；有的样品仅玉米内标基因zssiib和本发明设计的引物对有扩增产物，判定为阴性样品(图3)。实验结果与预期相吻合，可准确鉴定转基因玉米mir604的纯合体和杂合体。

(二)采用实时荧光pcr法鉴定mir604玉米的基因型

用三个引物/探针组合：本发明设计的引物探针组合mir604-qf/mir604-qr/mir604-qp、mir604转化体引物探针组合mir604f/mir604r/mir604p、玉米内标基因zssiib引物探针组合zssiib-f/zssiib-r/zssiib-p，扩增单株或单粒种子中提取的基因组dna。有的样品仅玉米内标基因zssiib和mir604转化体有典型扩增曲线，判定为纯合体；有的样品3个引物探针组合均有扩增产物，判定为杂合体；有的样品仅玉米内标基因zssiib和本发明设计的引物探针组合有扩增产物，判定为阴性样品(图4)。实验结果与预期相吻合，可准确鉴定转基因玉米mir604的纯合体和杂合体。

sequencelisting

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>基于插入位点基因组序列建立的鉴定玉米转化体mir604基因型的方法

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