用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的RT-LAMP引物及方法与流程

本发明涉及一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的rt-lamp引物及方法。

背景技术：

甲型h7n9流感病毒是禽流感病毒的一个亚型，原本属于低致病性流感病毒，仅在禽鸟中发现和传播。该病毒对禽鸟类的致死率低，经基因交换后具备了感染人类的能力，人感染h7n9病例的病发期短、重症率与死亡率均相对于sars略高。

2013年3月底人类感染h7n9禽流感病毒病例在上海和安徽两地首次出现。该h7n9流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。该病毒的血凝素蛋白(ha)基因在遗传学上不同于其他h7亚型病毒的ha基因，其6条内部基因片段来源于循环在东亚鸟类中的甲型h9n2流感病毒。神经氨酸酶蛋白(na)基因与前些年在鸟类中发现的甲型h11n9病毒的na基因片段相似。冬春之际反复出现的h7n9禽流感此前一直被认为是低致病性禽流感(lowpathogenich7n9influenzavirus,lp-h7n9)，农业部将它划为二类动物疫病。2013年11月，人感染h7n9禽流感被国家卫计委疾病预防控制局纳入法定乙类传染病，是出入境卫生检疫和进出境动物检疫的重要疫病之一。

2017年春爆发的第五波人感染h7n9流感疫情，呈现出与往年不同的特征与趋势：感染病例增多、分布地区广、散发程度高等特点。2017年2月，广东省疾病预防控制中心报道该中心1月份对两例人感染h7n9病例分离到的病毒分别进行基因测序分析，发现在该两株病毒的血凝素(ha)裂解位点发生基因插入性突变，提示该病毒已突变为对禽高致病性的h7n9病毒(hightlypathogenich7n9influenzavirus,hp-h7n9)。农业部门的实验室也从广东的4份禽标本中发现类似变异的病毒。

h7n9变异株成为高致病性病毒后，将对家禽生产带来非常严重的影响。致病性的增高意味着该病毒可造成禽只的大量死亡，蛋鸡的生产性能也将受到严重影响。而高致病性禽流感作为全世界高度关注的一类动物疫病，它对国内和国际动物贸易、社会经济生活等将产生深远影响。

现有技术中已有针对2013年以来发生的人感染h7n9禽流感病毒(经典h7n9毒株)的检测方法，如cn105200161a、cn103740863a、cn105861758a，及文献《h7n9禽流感病毒实时荧光rt-pcr检测方法的建立与评价》、《逆转录环介导等温扩增技术检测h7n9禽流感病毒基因》。但是，这些方法只能检测到经典的h7n9病毒，但不能识别对家禽更具威胁的高致病性h7n9毒株。

建立了一种快速、特异、高通量、低成本的新型诊断方法对主动应对h7n9禽流感病毒的基因变异，为新发高致病性h7n9禽流感病毒(hp-h7n9)的快速准确诊断做好准备具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的rt-lamp引物及方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的rt-lamp引物，包括一对外引物f3、b3，一对内引物fip、bip，其核苷酸序列如下所示：

f3：5’-acttgccatttcagaacataga-3’(seqidno：1)；

b3：5’-ctatcaacttaaattgttggttggt-3’(seqidno：2)；

fip：5’-gcctctcgcagtccgtt-tcttctgctggcaacagg-3’(seqidno：3)；

bip：5’-gcctaattgatggttggtatggtt-attgccgattgagtgctt-3’(seqidno：4)。

一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的试剂盒，含有上述的rt-lamp引物。

一种检测高致病性h7n9禽流感病毒的rt-lamp方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒核酸；

2)以步骤1)中提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物对f3、b3、fip和bip进行rt-lamp反应获得扩增产物；

3)对扩增产物进行分析，确定样品中是否含有高致病性h7n9病毒。

进一步地，步骤2)中rt-lamp反应体系为：

其中，内引物浓度为0.4μm～1.6μm，外引物浓度为0.05μm～0.2μm。

进一步地，内引物浓度为1.2μm，外引物浓度为0.1μm。

进一步地，rt-lamp反应温度为58℃～65℃。

进一步地，rt-lamp反应温度为60℃～64℃；优选地，荧光pcr反应温度为60℃。

进一步地，rt-lamp反应时间为50min～60min；优选地，荧光pcr反应时间为60min。

进一步地，步骤3)中对扩增产物进行分析是指对扩增曲线进行分析，当阴阳性对照均成立时，无“s”型扩增曲线的样品判定为阴性，有“s”型扩增曲线的样品判定为阳性。

进一步地，步骤3)中对扩增产物进行分析是指在扩增产物中加入显色液，呈橙色判定为阴性，呈绿色判定为阳性。

本发明的有益效果是：

本发明中根据genebank中公布的hp-h7n9的ha基因序列，设计特异性lamp引物，构建hp-h7n9重组克隆质粒作为阳性对照，经反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验，建立hp-h7n9rt-lamp检测方法。实验表明，本发明建立的hp-h7n9rt-lamp检测方法，可特异性检测hp-h7n9，而与低致病性h7n9流感病毒(lp-h7n9)、h7n3流感病毒、h3n2流感病毒、h5n1禽流感病毒、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h7亚型禽流感病毒(re-1疫苗株)、h9亚型禽流感病毒、甲型h1n1流感病毒(h1n1)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、新城疫病毒(ndv)等不发生交叉反应；可检测到最低浓度为5.94×10⁴copies/μl的阳性质粒；耗时仅为1.5～2h；检测成本较低；是hp-h7n9快速检测的良好方法。

本发明中的方法为hp-h7n9的口岸检疫、风险预警和疫情防控等提供强有力的技术支持，对于保护国内家禽养殖业生产安全、保障公共卫生安全也具有重要的现实意义。

附图说明

图1为引物浓度优化结果；

图2为rt-lamp反应温度优化试验，扩增曲线1～8对应的反应温度为58℃～65℃；

图3为rt-lamp不同反应时间显色结果；

图4为rt-lamp检测结果的判定(实时荧光法)；

图5为rt-lamp检测结果的判定(染色法)，p：阳性对照；s1：样品；s2：样品；n：阴性对照；

图6为特异性试验扩增曲线；

图7为特异性试验显色结果；

图8为敏感性试验(阳性质粒模板)，扩增曲线1～7所用质粒模板稀释度为10^-1～10^-7，p为阳性独照，n为阴性对照；

图9为敏感性试验(显色法)；

图10为敏感性试验(病毒核酸模板)。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

以下实施例中使用的灭活的高致病性h7n9禽流感病毒(鸡胚尿囊液，毒株编号为a/chicken/guangdong/q39/2017(h7n9))，低致病性h7n9病毒核酸(lp-h7n9)、h7n3流感病毒核酸(h7n3)、h3n2流感病毒核酸(h3n2)、h5n1禽流感病毒核酸(h5n1)、h9亚型禽流感病毒核酸(h9)、新城疫病毒(ndv)核酸、甲型h1n1流感病毒(h1n1)核酸、传染性法氏囊病病毒(ibdv)核酸、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)核酸由华南农大兽医学院禽病研究室惠赠，h5亚型(re-6疫苗株)、h5亚型(re-8疫苗株)和h7亚型(re-1疫苗株)禽流感病毒血凝抑制试验抗原来自哈尔滨维科生物技术开发公司。

以下实施例中阳性对照和阴性对照分别的制备方法如下：

阳性对照的制备：将目的片段(seqidno：5)提交华大基因进行基因合成，制作重组质粒whc183645-lamp330作为阳性对照。

阴性对照的制备：无菌采取spf鸡胚尿囊液，经检测通用a型流感病毒、ibdv、ibv和ndv等病毒核酸，结果均为阴性，作为阴性对照。

实施例1引物

经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现外引物f3和b3，内引物fip(由f1c、f2构成)和bip(由b1c、b2构成)对rt-lamp法检测hp-h7n9的效果最好，其碱基序列如下所示。

表1hp-h7n9rt-lamp引物

注：f3、b3为外引物，fip、bip为内引物。

hp-h7n9rt-lamp扩增目的片段序列如下：

(注：方框部分为外引物f3、b3；阴影部分为内引物fip对应区域；下划线部分为内引物bip对应区域)。

表2hp-h7n9rt-lamp扩增目的片段blastn检索结果(100％匹配)

实施例2病毒核酸提取

(1)取n个灭菌的1.5mleppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)，编号。

(2)每管加入600μl裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μl，再加入200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。

(3)取与步骤(1)相同数量灭菌的1.5mleppendorf管，加入400μl异丙醇(-20℃预冷)，做标记。吸取步骤(2)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取400μl，不能吸出中间层，颠倒混匀。

(4)于4℃、12000r/min离心15min(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600μl75％乙醇，颠倒洗涤。

(5)于4℃、12000r/min离心10min(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

(6)4000r/min离心10s(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5～10min。

(7)加入11μldepc水，溶解管壁上的rna，2000r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃冰箱。

实施例3lamp反应体系的建立与反应条件的优化

(1)引物浓度的优化

反应体系中内引物(fip/bip)终浓度从0.4μm至1.6μm以0.4μm递增，外引物终浓度(f3/b3)从0.05μm至0.2μm以0.05μm递增，采用矩阵法进行对比试验，确定反应体系中内外引物的最佳终浓度、比例，其它条件完全一致。反应时间为60min。

实验结果显示，16组内外引物终浓度组合中，除内引物(fip/bip)浓度为0.4μm的4组未出现扩增曲线外，其余12组引物组合均能产生扩增曲线(见图1)。内引物浓度为1.2μm和1.6μm时，扩增曲线进入指数增长期的时间明显早于内引物浓度为0.8μm的实验组。扩增曲线最早到达峰值平台的内外引物浓度组合为1.2μm–0.10μm，扩增曲线荧光峰值最高的内外引物浓度组合为1.6μm–0.20μm。基于时间效率及检测成本的考虑，选择1.2μm-0.1μm作为hp-h7n9lamp反应体系的内引物和外引物终浓度。通过优化确定的总体积为25μl的最佳反应体系见表3。

表3rt-lamp反应液组份

(2)以优化后的引物浓度为条件，确定最佳反应温度

反应温度以58℃为基础，以1℃递加，直到65℃，反应时间为60min。

如图2所示，58-65℃条件下均能产生扩增曲线，60℃、63℃、64℃时反应效率和扩增曲线最优(图2中编号为3、6、7的扩增曲线)。综合考虑扩增曲线进入指数增长期的时间和荧光峰值强度，选择60℃作为hp-h7n9rt-lamp的最佳反应温度。

(3)使用染色法(显色观察)时最短反应时间的确定

以优化后的引物浓度配制反应体系，在各反应管管盖内侧中央加1μl显色液，使用10^-3稀释度的阳性质粒为模板，以优化后的反应温度为条件，反应时间分别设为10、20、30、40、50和60min进行rt-lamp，反应结束后颠倒反应管数次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察反应液颜色情况。

试验结果(见图3)表明，使用10^-3稀释度的阳性质粒作为模版时rt-lamp检测hp-h7n9所需的最短反应时间为50min；为保证检测敏感性，选择60min作为反应时间。

内引物浓度是影响反应效率的重要因素，从试验结果看，内引物浓度在1.2和1.6μm时，扩增反应进入指数增长期的时间显著短于内引物浓度为0.8μm的时间(见图1)，即内引物的浓度越高，起始阶段开始的合成反应就越多，反应效率越高；内引物浓度为0.4μm时未出现扩增曲线。扩增曲线荧光峰值最高的内外引物浓度组合为1.6μm–0.20μm。内外引物浓度的最适比例为8:1～16:1，在此范围内都能取得较好的扩增效果。基于时间效率和检测成本的考虑，本方法确定的内外引物最佳浓度分别为1.2、0.1μm。

反应温度对lamp的影响主要作用于bst聚合酶，温度降到58℃时，虽然反应仍能进行，但酶的活性很弱，反应效率较低(notomi等,2000)。经试验发现，本方法在58～65℃均能产生扩增曲线，与试剂盒说明相符，即在bst聚合酶活性温度范围内均能正常扩增。60℃、63℃、64℃时反应效率和扩增曲线最优，综合考虑扩增曲线进入指数增长期的时间和荧光峰值强度，本方法选择60℃作为最佳反应温度。

以优化后的引物浓度和反应温度为条件，使用10^-3稀释度的阳性质粒作为模版时，染色法观察结果需要的反应时间为50～60min，为保证检测敏感性，应使用60min反应时间；采用实时荧光法时，扩增曲线在50min前一般都进入了平台期，因此推荐反应时间为60min即可。

按lamp反应体系(见表2)配制反应混合物放入等温扩增仪，设置扩增温度为60℃、反应时间为60min，进行lamp检测。反应结束后，仪器自动分析试验结果，显示扩增曲线(见图4)。当阴阳性对照均成立时，无“s”型扩增曲线的样品判定为阴性，反应体系中加入显色液后呈橙色；有“s”型扩增曲线的样品判定为阳性(样品s)，反应体系中加入显色液后呈绿色。扩增产物加入显色液后的颜色见图5。

实施例4特异性试验

按实施例2方法提取hp-h7n9病毒核酸，分别以hp-h7n9、lp-h7n9、h7n3、h3n2、h5n1、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h7亚型禽流感病毒(re-1疫苗株)、h9、h1n1、ibdv、ibv、ndv等病毒核酸作为模板。按表3的体系配制反应液，按照优化后的反应温度，进行特异性试验，同时设阳性对照和阴性对照。

同时使用显色法进行特异性评价，配制反应体系并在各反应管管盖内侧中央加1μl显色液，加入模板后反应60min，反应结束后颠倒反应管数次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察反应液颜色情况。

特异性试验中，只有阳性对照和hp-h7n9模板出现扩增曲线，而lp-h7n9、h7n3、h3n2、h5n1、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h7亚型禽流感病毒(re-1疫苗株)、h9、h1n1、ibdv、ibv、ndv和阴性对照均未观察到s型扩增曲线，试验结果见图6、图7和表4，扩增产物显色情况见图7。

表4特异性实验结果

lamp反应由针对靶基因6个区域的4条特异性引物启动，6个区域中任何一个引物不匹配均会导致lamp扩增不成功，几乎不可能出现非特异性扩增情况。试验的结果表明本方法只对hp-h7n9进行了特异性扩增，而对lp-h7n9、h7n3流感病毒、h3n2流感病毒、h5n1禽流感病毒、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h7亚型禽流感病毒(re-1疫苗株)、h9亚型禽流感病毒、甲型h1n1流感病毒(h1n1)、ibdv、ibv、ndv、h7亚型禽流感病毒(re-1疫苗株)等核酸不发生扩增，具有极高的特异性。

实施例5敏感性实验

阳性质粒测定浓度后，以10倍梯度稀释到10^-11，对梯度稀释的样品按照优化后的引物浓度和反应温度进行lamp检测。

测定hp-h7n9攻毒鸡胚尿囊液的血凝效价，将其倍比稀释至2^-28，提取各稀释度尿囊液的病毒核酸，以稀释度分别为2^-1、2^-4、2^-8、2^-12、2^-16、2^-16、2^-20、2^-24、2^-28的尿囊液所提核酸为模版，进行hp-h7n9rt-lamp检测，测试能检测到hp-h7n9核酸的尿囊液最高稀释倍数。

合成阳性质粒溶解后浓度为50ng/μl，换算成拷贝数浓度为5.94×10¹⁰copies/μl。试验结果表明，本方法最低可检测到阳性质粒的10^-6稀释倍数(模板量为5μl)，换算成拷贝数浓度为5.94×10⁴copies/μl，结果见图8～图9。

hp-h7n9攻毒鸡胚尿囊液的血凝效价为2⁵。以稀释度分别为2^-1、2^-4、2^-8、2^-12、2^-16、2^-16、2^-20、2^-24、2^-28的尿囊液所提核酸为模版，进行hp-h7n9rt-lamp检测，能检测到hp-h7n9核酸的尿囊液最低稀释度为2^-24，荧光扩增曲线见图10。

荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察反应液显色的灵敏度，因此用荧光信号显示lamp扩增产物的量，能获得较高的检测精度。实验表明，本方法检测hp-h7n9阳性质粒的最低稀释度为10^-6，换算成拷贝数浓度约为5.94×10⁴copies/μl，具有较好的敏感性。

试验所用的hp-h7n9攻毒鸡胚尿囊液的血凝效价为2⁵，提取倍比稀释的各稀释度尿囊液的病毒核酸，进行hp-h7n9rt-lamp，能检测到hp-h7n9核酸的尿囊液最低稀释度为2^-24，表明本方法的敏感性远高于经典的血清学方法。

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<110>拱北海关技术中心

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