一种用于检测Top2A基因的探针、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测top2a基因的探针、试剂盒及检测方法。

背景技术：

乳腺癌是妇女中常见的恶性肿瘤之一，近年来，在我国的发病率呈直线上升的趋势。临床研究表明，top2a基因异常的乳腺癌患者的无复发生存期(recurrence-freesurvival，rfs)缩短，预后差，尤其是top2a基因缺失的乳腺癌患者预后更差。top2a基因异常的患者接受蒽环类药物的化疗方案效果要优于top2a基因正常的患者。top2a基因扩增的患者使用环磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶(cyclophosphamide+epirubicin+fluorouracil，cef)方案进行治疗可降低61％的复发风险和51％的死亡风险，而top2a基因没有扩增的患者使用cef方案只能降低6％的复发风险和10％的死亡风险。因此，检测乳腺癌患者中top2a基因的状态有助于判断预后以及指导临床合理用药，对于治疗乳腺癌具有显著帮助。

目前商业化的top2a基因荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，fish)检测探针主要使用细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，bac)或者pcr产物经过荧光分子标记后作为探针。由于bac和pcr产物探针存在一些非特异性序列，使得荧光原位杂交探针的特异性不高，信号背景偏高，并且现有的荧光原位杂交探针的片段通常偏大，使其杂交效率偏低，杂交时间长。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测top2a基因的探针，该探针降低了非特异性反应，减少了背景信号，并且提高了杂交效率，缩短杂交时间。

第一方面，本发明提供一种用于检测top2a基因的探针，包括top2a基因特异性探针，所述top2a基因特异性探针上连接有荧光基团，所述top2a基因特异性探针序列为seqidno.1-seqidno.26中的任一个或几个。

进一步的，还包括17号染色体特异性探针，所述17号染色体特异性探针上连接有荧光基团，所述17号染色体特异性探针序列为seqidno.27。

进一步的，所述top2a基因特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团，所述17号染色体特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。

进一步的，所述top2a基因特异性探针与所述17号染色体特异性探针按照1:1的质量比混合。

第二方面，本发明提供一种用于检测top2a基因的试剂盒，包括上述第一方面所述的用于检测top2a基因的探针。

进一步的，所述试剂盒还包含杂交液、缓冲液和复染液。

进一步的，所述缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液，所述复染液包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液。

第三方面，本发明提供一种top2a基因的检测方法，使用上述第二方面所述的试剂盒进行，所述检测方法包括：

将待检测样品固定在玻片上；

将所述top2a基因特异性探针与所述17号染色体特异性探针混匀得到用于检测top2a基因的探针；

将所述用于检测top2a基因的探针与所述待检测样品进行核苷酸序列的变性杂交；

所述变性杂交后，对所述玻片进行洗涤；

使用复染液对所述玻片上的杂交区域进行复染；

使用荧光显微镜观察所述玻片的杂交区域。

进一步的，所述变性杂交于80-90℃金属块上反应6-10min。

进一步的，对所述玻片进行洗涤包括：

先使用2×柠檬酸钠缓冲液洗涤所述玻片，再使用0.4×柠檬酸钠缓冲液洗涤所述玻片。

本发明的有益效果：

本发明技术方案的探针序列针对基因组非重复区设计，降低了非特异性反应，减少了背景信号；本发明的探针是单链dna，减少了探针自身的配对，提高了杂交效率；本发明的探针片段小，能够快速的与靶向序列结合，缩短杂交时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的用于检测top2a基因的探针的检测结果示意图。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)。

本发明提供一种用于检测top2a基因的探针，包括top2a基因特异性探针，所述top2a基因特异性探针上连接有荧光基团，所述top2a基因特异性探针序列为seqidno.1-seqidno.26中的任一个或几个。

本发明的用于检测top2a基因的探针，通过在top2a基因区域每隔3bp设计一个长度100nt-300nt的候选探针序列，然后将候选探针序列进行blast比对，去除具有非特异性的重复区域的候选探针序列，并通过打分去除非特异tm值过高的探针。选择非重叠的候选探针，共获得26个合格探针序列。本发明探针可以通过人工合成得到，也可以通过pcr反应得到，在此不做限定。本发明探针片段小，可以在保证特异性的情况下更加快速的与靶向序列结合，缩短杂交时间。

进一步的，用于检测top2a基因的探针还包括17号染色体特异性探针，所述17号染色体特异性探针上连接有荧光基团，所述17号染色体特异性探针序列为seqidno.27。

可选的，所述top2a基因特异性探针与所述17号染色体特异性探针均溶解于纯水中，质量浓度为100-300ng/μl。

具体的，17号染色体特异性探针作为top2a基因特异性探针的对照探针，针对17号染色体着丝点附近的重复区设计，在设计时通过blast比对去除与其他染色体序列相近的序列，降低了非特异杂交，减少背景信号。17号染色体特异性探针用于判断17号染色体的扩增情况，由于每条染色体有两个姐妹染色单体，每个姐妹染色单体上都有top2a基因，在染色体完全没有分离的情况下top2a基因与17号染色体的比值为2，在染色体完全分离的情况下top2a基因与17号染色体的比值为1，因此可通过top2a基因与17号染色体的比值来判断top2a基因的扩增和缺失情况。

进一步的，所述top2a基因特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团，所述17号染色体特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。

具体的，top2a基因特异性探针和17号染色体特异性探针在制备过程中掺入氨基-dutp，利用氨基反应性alexafluor488-n-羟基琥珀酰亚胺酯制备的偶联物在top2a基因特异性探针偶联上绿色荧光基团，利用氨基反应性alexafluor594-n-羟基琥珀酰亚胺酯制备的偶联物在17号染色体特异性探针偶联上红色荧光基团。

alexafluor488染料能发出明亮的绿色荧光，光谱与荧光素相似，在ph4至ph10之间稳定。可被488nm光激发产生信号稳定的荧光，常作为一种细胞标记物偶联到抗体、多肽、蛋白、示踪剂和其他底物上广泛用于细胞成像和检测。alexafluor488nhsester，即含n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide)活化基团的alexafluor488，可直接与生化分子上的氨基(-nh2)反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺，可用于标记任何含伯胺的蛋白、多肽、氨基修饰的寡核苷酸或者其他含氨基的生物分子。

由于top2a基因特异性探针带有绿色荧光基团，17号染色体特异性探针带有红色荧光基团，因此可通过绿色荧光信号与红色荧光信号的比值来判断top2a基因的扩增和缺失情况，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值大于2时，证明top2a基因发生了扩增，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值小于1时，证明top2a基因发生了缺失，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值在1-2之间时，top2a基因正常。

本发明还提供一种用于检测top2a基因的试剂盒，包括序列为seqidno.1-seqidno.26中的任一个或几个的top2a基因特异性探针和序列为seqidno.27的17号染色体特异性探针。

具体的，所述试剂盒还包含杂交液、缓冲液和复染液。所述缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸钠缓冲液的ph为4.0-6.0，所述复染液包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)，所述dapi的工作浓度为0.1-0.3mmol/l。

本发明最后还提供一种使用上述试剂盒检测top2a基因的方法，包括如下步骤：

将待检测样品固定在玻片上；

将所述top2a基因特异性探针与所述17号染色体特异性探针混匀得到用于检测top2a基因的探针；

将所述用于检测top2a基因的探针与所述待检测样品进行核苷酸序列的变性杂交；

所述变性杂交后，对所述玻片进行洗涤；

使用复染液对所述玻片上的杂交区域进行复染；

使用荧光显微镜观察所述玻片的杂交区域。

优选的，所述变性杂交于80-90℃金属块上反应6-10min。

优选的，对所述玻片进行洗涤包括：

先使用2×柠檬酸钠缓冲液洗涤所述玻片，再使用0.4×柠檬酸钠缓冲液洗涤所述玻片。

高浓度的柠檬酸钠缓冲液洗涤玻片可以洗去部分非特异性结合的探针，低浓度的柠檬酸钠缓冲液洗涤玻片可以使探针与目的系列的核酸链结合更紧密。

下面将结合具体实施例详细描述本发明提供的探针和试剂盒用于检测top2a基因的应用，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

fish检测

准备工作：准备盖玻片和载玻片，并用75％酒精擦拭盖玻片和载玻片；金属块85度预热；水浴锅50℃预热；准备37℃烘箱；准备金属材质且不透光的湿盒；配制150ml2×柠檬酸钠缓冲液，1ml4×柠檬酸钠缓冲液，50ml0.4×柠檬酸钠缓冲液。整个实验过程都需要注意避光。

待检测样品预处理：待检测样品为hl60细胞系，使用pbs缓冲液制备成细胞悬浮液，用移液器吸取10μl细胞悬浮液滴加在载玻片上，室温晾至标本边缘已干但是中间还没有干透时滴加固定剂25μl，固定剂干之后得到切片用于后续实验。

混合探针：top2a基因特异性探针为序列seqidno.1-seqidno.26探针的混合探针，混合探针溶解于纯水中，浓度为200ng/μl；17号染色体特异性探针为序列seqidno.27探针，探针溶解于纯水中，浓度为200ng/μl。将15μl杂交液、0.5μltop2a基因特异性探针和0.5μl17号染色体特异性探针进行混合，充分混匀，避免气泡产生，混匀后离心。所述杂交液为2×柠檬酸钠缓冲液。

其中，所述top2a基因特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团，所述17号染色体特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。

变性杂交：取15μl混合探针的杂交液轻轻滴加到样品上，枪头不要接触玻片，避免产生气泡，如有较大气泡需用枪吸走，小气泡无影响，盖玻片轻轻从一侧缓慢盖住杂交液。待杂交液均分铺开后用封片胶封片，玻片周围需全部封住，勿遗留缺口，如有未封住的缺口则继续补加封片胶。待封片胶干燥呈完全透明状态后，将玻片置于85℃金属块上8min，加盖避光。

玻片洗涤：在湿盒内垫5层吸水纸，用去离子水湿润，吸水纸上放入一塑料盒，用于隔开玻片与吸水纸。在一个片缸中加入30-40ml2×柠檬酸钠缓冲液，放入50℃水浴锅预热。在另一个片缸中加入常温30-40ml2×柠檬酸钠缓冲液。

8分钟变性完毕后迅速将玻片放入湿盒，并将湿盒放入37℃烘箱孵育2小时，然后取出玻片，揭开封片胶。在玻片周围滴加200μl4×柠檬酸钠缓冲液，等待3分钟后，轻轻揭去盖玻片，揭片过程避免左右滑动损伤细胞。倒掉玻片上的4×柠檬酸钠缓冲液，将玻片插入水浴锅50℃预热的片缸中放置5分钟。5分钟后将玻片转移至常温片缸中放置5分钟。5分钟后再将玻片转移至常温片缸中放置5分钟。

取出玻片在0.4×柠檬酸钠缓冲液中轻轻荡洗6秒，取出玻片，直立于吸水纸上，除去0.4×柠檬酸钠缓冲液，擦镜纸轻轻擦除细胞周围的0.4×柠檬酸钠缓冲液，并用75％酒精擦洗盖玻片，擦干。

复染：向玻片上的杂交区域滴加一滴复染液，轻轻从一侧盖住盖玻片，切忌反复移动盖玻片。等待2分钟后，待复染液均匀铺开，用指甲油封片，先封住四角，常温放置1小时后封住余下部分。

fish结果观察：封片20分钟后使用荧光显微镜对玻片上的杂交区域进行观察。

结果如图1所示，从图1中可看出，本发明的检测top2a基因的探针可以与目的序列稳定结合并产生荧光信号，图1中，绿色荧光信号与红色荧光信号的数量比值在1-2之间，即top2a基因没有发生扩增或缺失的情况，检测结果可靠准确，特异性高，检测时间大大缩短，为后期临床应用提供可能。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

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<110>广州简册生物技术有限公司

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