一种快速检测土拉杆菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测土拉杆菌的试剂盒。

背景技术：

土拉杆菌(francisellatularensis)即土拉弗朗西斯菌，简称土拉菌，为革兰氏染色阴性的多形态的小球杆菌(0.2-0.7μm×0.2μm)，一般为0.3～0.5μm大小，且不形成芽胞，嗜氧。土拉杆菌包含tularensis(a型)、holarctica(b型)、novicida与mediasiatica四个亚种。人类的土拉菌病多数由a型和b型土拉杆菌引起，土拉杆菌的储存宿主主要是家兔和野兔(a型)以及啮齿动物(b型)。a型主要经蜱和吸血昆虫传播，而被啮齿动物污染的地表水是b型的重要传染来源。

土拉杆菌病，又称野兔热，是由土拉杆菌(francisellatularensis)引起的，一种急性、感染性人畜共患疾病，发生在北半球的多数国家，流行于北纬30°～71°地区。病原菌自皮肤破损处侵入人体后，于2至5日内(1～10日)局部形成红斑或丘疹、皮损扩大并形成溃疡，细菌即循淋巴管侵入附近淋巴结，并引起炎症。土拉杆菌属细胞内生长菌，细菌被吞噬细胞吞噬后，不一定被杀灭，且可从淋巴结中逸出，进入血液循环而引起菌血症，并侵入全身脏器，其中肝、脾、深部淋巴结、骨髓等网状内皮系统摄菌尤多。肝、脾与淋巴结(继发性)中有结核性肉芽肿，具一定特征性。肉芽肿无出血，是与鼠疫区别的重要标志。

病原菌由呼吸道吸入后，可被肺泡内的巨噬细胞所吞噬，若在肺泡内不被消灭，则病原菌繁殖，周围可出现炎症反应，伴肺泡壁坏死，纵隔淋巴结常肿大。肉眼可见散在的斑片状支气管肺炎，某些可相互融合。肺内结核样肉芽肿的形成较其他部位为少。

随着进展，土拉杆菌输入并在我国本土传播的风险不断增大。土拉杆菌的依赖实验特异性的检测，其检测周期较长、在实际需要快速检测的工作中难以推广应用。

因此，提供一种快速检测土拉杆菌的试剂盒，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种快速检测土拉杆菌的试剂盒，本试剂盒利用2条引物来特异性识别目标片段，有核酸检测的高特异性、高敏感性，同时具有反应快速、操作简单、不依赖大型仪器等特点，更适合在国境口岸快速通关背景下的现场使用需求。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据genebank号：kf607098.1公开的土拉杆菌外膜蛋白基因fopa，设计一种快速检测土拉杆菌的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

fp：5’-ccttttgcaaatacttatagcgcttgccagttctatcttgagga-3’；

bp：5’-ccttttgcaaatacttatagcttatcgatacgtcagcaaacac-3’。

含有上述的特异性引物对的试剂盒。

进一步的，所述试剂盒包括ph为8.8的反应液、dntps、bstdna聚合酶、fp及bp引物、指示剂和封闭剂。

优选的，所述封闭剂为石蜡，加入一滴即可。

进一步的，在最终反应体系中：dntps1.4mm、bstdna聚合酶8u、fp及bp引物各80pmol；

反应液含tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween20和甜菜碱；各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：tris-hcl20.0mm、(nh4)2so410mm、kcl50mm、mgso48mm、tween200.1％和甜菜碱0.8m。

进一步的，所述指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂；所述指示剂包括甲酚红0.08mm和苯酚红0.02mm。所述荧光染料为1×水溶液的sybrgreeni或evegreen。

本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中试剂瓶设有检测管、检测管盖、放置槽和覆膜；其中，检测管为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖与检测管相适配，覆盖在检测管的开口端，封闭检测管，其中检测管与检测管盖一体成型；检测管盖内侧设置放置槽，放置槽与检测管盖一体成型；覆膜为ppe薄膜，覆盖在放置槽上。

其中，本发明将试剂dntps、bstdna聚合酶、fp及bp引物、指示剂、荧光染料置于检测管盖上的放置槽内，然后利用覆膜对放置槽进行封口，并将反应液放置到检测管底部再加入封闭剂，最后盖上检测管盖，完成试剂盒的组装。

气溶胶污染是困扰整个核酸扩增领域的难题，聚合酶螺旋反应扩增效率高，反应剧烈，将气溶胶污染封闭剂在反应前加入到反应管中，反应过程中熔化成液体覆盖反应液，阻止了气溶胶的挥发，并且对扩增反应无影响，反应完成后会再次凝结成固体，永久封闭反应液，杜绝了污染。

试剂盒检测土拉杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)利用chelex裂解液对待检测样品进行混合，加热裂解；

(2)将步骤(1)裂解后的样品液作为dna模板，加入反应体系中；并设置阳性和阴性对照；

(3)在65℃的条件下，恒温扩增40min，显色法观察判断结果或利用荧光法进行检测。

其中取5.0gchelex-100(bio-rad)和1.0mltritonx-100溶于100mlte缓冲液(tris10mm,edta1mm)中制成chelex裂解液。

其中，显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在土拉杆菌基因(阳性)，检测管颜色变为红色表示待测样本中不存在土拉杆菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管30-50分钟内颜色变为红色，则本次检测结果无效，应重新检测。

显色法检测原理为：当dna聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的dna双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着psr反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的ph值降低。将ph指示剂溶液在反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液为红色。

荧光实时检测方法的原理为：核酸荧光染料可以镶嵌到dna双链里，在特定激发波长荧光激发下，可以发出荧光，进而被仪器检测到。

荧光实时检测方法为：设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中，开始反应。

阳性反应的表现为：在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；

阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。

结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，样本在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(tm变化范围在1-3℃之内)，此时样本可以判断为阳性。否则为阴性。如果阳性样本发生了阴性反应，或者阴性样本发生了阳性反应，应重新实验。

进一步的，所述反应体系为30μl体系，包括：ph为8.8的所述反应液15μl、1μl混合液和dna模板量14μl；其中所述混合液包含dntps、bstdna聚合酶、fp及bp引物，以及指示剂和/或荧光染料。

进一步地，混合液的溶剂为水和/或玻璃化液。

玻璃化液选自二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇(eg)、丙二醇、丙三醇等试剂中任意2种以上的组合；或者选自efs30玻璃化液、efs40玻璃化液、edfs30玻璃化液、edfs40玻璃化液、edfsf30玻璃化液或edfsf40玻璃化液。

efs30玻璃化液中含有30％v/veg，70％v/vfs溶液；

efs40玻璃化液中含有40％v/veg，60％v/vfs溶液；

edfs30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfs溶液；

edfs40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfs溶液；

fs溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解成fs溶液。

edfsf30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfsf溶液；

edfsf40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfsf溶液；

fsf溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解后，加20％胎牛血清后制成fsf溶液。

进一步地，混合液置于检测管盖上的放置槽内后，晾干或烘干。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种快速检测土拉杆菌的试剂盒，具有如下技术优点：

1.本发明提供的一种快速检测土拉杆菌的试剂盒，样本经过现场简单处理，即可进行核酸扩增检测，结果直观可肉眼判读，将传统的病原体pcr检测从4个小时减少至50分钟，其中样品包括。

2.降低了实验操作难度，以及对专业素质要求，适用于口岸及出入境检验检疫工作人员针对土拉杆菌的现场快速检测。

3.该试剂盒对环境无要求，利用自带试剂即可完成检测、判读结果。部分试剂经玻璃化后可以室温储存运输，不依赖冷链运输和低温保存。

4.该试剂盒成本低，对于现场筛查更为适用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的一元包装诊断试剂瓶的结构示意图；

其中，1为检测管、2为覆膜、3为检测管盖、4为放置槽；

图2附图为本发明提供的显色法检测土拉杆菌敏感性实验结果；

图3附图为本发明提供的荧光法检测土拉杆菌敏感性实验结果；

图4附图为本发明提供的显色法检测土拉杆菌血液样本检测结果；

图5附图为本发明提供的荧光法检测土拉杆菌特异性检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

试剂盒的制备

本实施例中chelex-100、甜菜碱，sigma公司；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、edta、硫酸铵，国药集团化学试剂有限公司；tris-hcl，上海生科生物科技有限公司；tritonx-100，北京美莱博医学科技有限公司；dntp，pharmacia公司。

根据genebank号：kf607098.1公开的土拉杆菌外膜蛋白基因fopa，设计一种快速检测土拉杆菌的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

fp：5’-ccttttgcaaatacttatagcgcttgccagttctatcttgagga-3’；seqidno.1；

bp：5’-ccttttgcaaatacttatagcttatcgatacgtcagcaaacac-3’；seqidno.2；

本实施例中的试剂盒包括ph为8.8的反应液、dntps、bstdna聚合酶、fp及bp引物，以及指示剂或荧光染料。

在最终反应体系中：dntps1.4mm、bstdna聚合酶8u、fp及bp引物各80pmol。

反应液含tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween20和甜菜碱；各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：tris-hcl20.0mm、(nh4)2so410mm、kcl50mm、mgso48mm、tween200.1％和甜菜碱0.8m。

指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，在最终反应体系中甲酚红工作浓度0.08mm，苯酚红工作浓度0.02mm。

荧光染料为1×水溶液的sybrgreeni(工作浓度)。

本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，如图1其中，试剂瓶设有检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，覆盖在检测管1的开口端，封闭检测管1，其中检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为ppe薄膜，覆盖在放置槽4上。

本实施例采用反应体系为30μl体系，包括：ph为8.8的反应液15μl、1μl混合液和dna模板14μl；其中混合液包含dntps、bstdna聚合酶、fp及bp引物以及指示剂或荧光染料，溶剂为efs30玻璃化液。

其中，混合液置于检测管盖3上的放置槽4内，晾干后然后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将反应液放置到检测管1底部再加入封闭剂1滴，最后盖上检测管盖3，完成试剂盒的组装。

实施例2

本实施例利用实施例1中的试剂盒，对环境样本进行检测。其中，用无菌生理盐水或chelex裂解液浸湿无菌采样棉签，擦拭受污物体表面，并将其放入含2mlchelex裂解液的处理管内，折断棉签杆将处理管盖紧后混匀后，置于智能恒温检测仪95℃、加热10分钟得到样品裂解液，后取出，待检。

打开实验组检测管，撕去覆膜，分别取14μl样品裂解液作为dna模板，分为2滴，滴加至实验组检测管的检测管盖上，扣上检测管盖，倒置约10秒。同时设置阳性对照和阴性对照。分别拿起实验组检测管、阳性对照管和阴性对照管，将管盖上的液体用力甩至管底内。再将实验组检测管、阳性对照管和阴性对照管置于智能恒温检测仪，点击扩增键，65℃开始加热，2分钟后看到封闭剂融化，拿出实验组检测管、阳性对照管和阴性对照管迅速甩动两下，让反应液充分混合，会观察到红色液滴和底部反应液混合，然后再置于恒温装置，听到提示音反应结束(预设40min)，取出，同时反应过程中切勿开盖。

待实验组检测管、阳性对照管和阴性对照管冷却至室温，肉眼观察。在阴性对照管颜色为红色，阳性对照管颜色变为黄色的条件下，检测管变为黄色表示待测样本中存在土拉杆菌基因(阳性)；检测管颜色为红色，表示待测样本中不存在土拉杆菌基因(阴性)。

实施例3

以含有土拉杆菌基因的质粒克隆株为检测对象，计算拷贝数进行10倍稀释度稀释，使得最终核酸浓度分别为10⁹拷贝/μl，10⁸拷贝/μl，10⁷拷贝/μl，10⁶拷贝/μl，10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，10⁰拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照。然后利用实施例1中的试剂盒进行检测；分别采用显色法(添加ph指示剂)和荧光法(设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中)来检测，结果如图2、3所示。

如图2，核酸浓度从左到右依次为10⁹拷贝/μl，10⁸拷贝/μl，10⁷拷贝/μl，10⁶拷贝/μl，10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，双蒸水(阴性对照)；最低检测浓度为1000拷贝/μl，有明显的颜色改变。

如图3，本发明试剂盒荧光法试验检测不同浓度的土拉杆菌基因(质粒)，从左到右红橙黄绿青蓝紫色曲线，代表的核酸浓度依次为10⁹拷贝/μl，10⁸拷贝/μl，10⁷拷贝/μl，10⁶拷贝/μl，10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，双蒸水(阴性对照)，结果显示扩增曲线有典型s型扩增曲线的最低检测浓度为1000拷贝/μl。荧光法与显色法实验结果一致。

实施例4

本实施例利用实施例1中的试剂盒对人血清进行检测。其中，分别无菌采集疑似病例静脉血3ml～5ml，室温静置数分钟使血液凝固，上层待用，用采样棉签沾取血清，沾取时覆盖整个棉签头部(约50-100μl)，充分吸取，后放入含2mlchelex裂解液的处理管内，折断棉签杆将处理管盖紧后混匀后，置于智能恒温检测仪95℃、加热10分钟得到样品处理液，后取出，使用实施例2方法检测。

如图4所示，1为阳性对照，2-5为血液样本，6为阴性对照，阳性对照变为黄色，阴性对照为粉色。检测的4个份人血清液样本均为粉色，土拉菌核酸检测结果均为阴性。

实施例5

使用实施例1试剂盒进行特异性试验。

分别对土拉菌、鼠疫菌、布鲁菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、雷氏普罗威登斯菌、肺炎克雷伯菌、双蒸水进行扩增。

如图5所示，tube1土拉菌质粒，tube2鼠疫菌、tube3布鲁菌、tube4金黄色葡萄球菌、tube5大肠埃希氏菌、tube6雷氏普罗威登斯菌、tube7肺炎克雷伯菌、tube8双蒸水，土拉菌阳性质粒样品呈典型s性扩增曲线，ct值14.3，判为阳性；其余样品无扩增曲线，判为阴性。说明检测试剂的特异性好。

本发明提供的一种快速检测土拉杆菌的试剂盒，样本经过现场简单处理，即可进行核酸扩增检测，结果直观可肉眼判读，将传统的病原体pcr检测从4个小时减少至50分钟，不仅降低了实验操作难度，以及对专业素质要求，适用于口岸及防疫工作人员针对土拉杆菌的现场快速检测；而且且该试剂盒对环境无要求，利用自带试剂即可完成检测、判读结果，成本较低。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>一种快速检测土拉杆菌的试剂盒

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>dna

<213>artificial

<400>1

ccttttgcaaatacttatagcgcttgccagttctatcttgagga44

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<400>2

ccttttgcaaatacttatagcttatcgatacgtcagcaaacac43