一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒。
背景技术：
：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)俗称绿脓杆菌，环境中普遍存在，尤其在潮湿环境。铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一，常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。该菌引起的感染病灶可导致血行散播，进而发生菌血症和败血症，因而，烧伤后感染铜绿假单胞菌可能造成死亡。该菌易感染者为患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤以及术后或某些治疗后的患者。该菌可通过医护人员传给病人，是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌；该菌还是尿路感染的常见病原菌，也是外耳炎的常见病原菌；因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染该菌，可造成眼部感染角膜溃疡；足部外伤或深部穿刺伤后，引流的窦道可发现该细菌，引起蜂窝织炎和骨髓炎；罕见情况下感染于心脏手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜，该菌可引起心内膜炎。根据国家标准，在化妆品、卫生用品中，铜绿假单胞菌等致病菌不得检出。目前对铜绿假单胞菌的检测多是细菌分离培养和生化鉴定，时间长，操作复杂。随着病原菌核酸检测技术的发展，pcr、荧光实时pcr检测方法也陆续出现。尤其是随着恒温扩增技术快速发展，国外已陆续出现多种原理的恒温扩增技术，如转录依赖的扩增系统tas、自主序列复制3sr、依赖于核酸序列的扩增nasba等，这些技术目前只能扩增rna，在反应过程中需要不断添加酶，而且在产物检测上仍需要复杂的后续程序。链替代扩增sda，仍需要变性的过程，扩增的靶序列不能超过200bp，后续检测复杂。滚环扩增rca扩增产物复杂。依赖解旋酶基因扩增had，扩增需要三种酶，限制了其应用范围。目前恒温扩增技术中环介导恒温扩增lamp技术最有优势，只需一种酶、扩增效率高，是目前inat技术中应用最多、论文发表量最大的方法。但lamp需要至少6条引物引物设计复杂，产物过于复杂导致假阳性率偏高，且lamp产物回收测序很困难，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性较强。同时常用的核酸检测结果判读方法包括琼脂糖凝胶电泳法、荧光成像法、核酸薄膜层析试纸条法和实时浊度法等方法，但它们都有一个共同的特点即需要专业的仪器，且对操作人员专业水平要求较高。从待测生物样本中提取核酸是核酸检测的第一步。核酸提取过程一般采用基于胍盐裂解法、硅膜法、磁珠法等各种原理的试剂盒，或者是采用核酸自动化提取仪，但用试剂盒提取核酸费时费力、操作复杂，往往需要2小时以上的时间，不能满足即时检测快速、简便的需求，核酸自动化提取仪能实现高通量且操作简便，但比较笨重、维护成本高。因此，基于目前已有的检测铜绿假单胞菌的手段存在灵敏度不够及实验条件要求高等缺点，提供一种灵敏、简便、快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测铜绿假单胞菌的特点，适合大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：根据ncbi(referencesequence:nc_002516.2)公开的铜绿假单胞菌toxa基因序列，设计一种双指示剂快速检测铜绿假单胞菌的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：ft：5’-gcatcgtcttcggcggggtggagcgcggctatgtgt-3’；seqidno.1；bt：5’-gcatcgtcttcggcggggttcgggttcctggtcctg-3’；seqidno.2；if：5’-aaggtgccgtggtagcc-3’；seqidno.3；ib：5’-tctatatcgccggcgatcc-3’；seqidno.4。其中，if和ib作为加速引物，被引入后，反应速率大大提高，在后期进行浊度检测时，ct值提前至20min以内。含有上述的特异性引物对的试剂盒。进一步的，包括试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含bstdna聚合酶，ft、bt引物，if、ib引物，dntp和指示剂；试剂二包含(nh4)2so4、kcl、mgso4、0.2％tween20和甜菜碱，ph8.0。进一步的，所述试剂一10ubstdna聚合酶，ft、bt引物各50μm，if、ib引物各50μm，10mmdntp和指示剂；试剂二包含20mm(nh4)2so4、100mmkcl、16mmmgso4、0.2％tween20和1.6m甜菜碱，ph8.0。其中，bstdna聚合酶不含甘油。进一步的，所述指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂和/或荧光染料；所述甲酚红-苯酚红指示剂包括终浓度0.08mm的甲酚红和终浓度0.02mm的苯酚红。荧光染料为1×水溶液的sybrgreeni或evegreen(工作浓度)。进一步地，封闭剂为石蜡。本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中试剂瓶设有检测管、检测管盖、放置槽和覆膜；其中，检测管为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖与检测管相适配，覆盖在检测管的开口端，封闭检测管，其中检测管与检测管盖一体成型；检测管盖内侧设置放置槽，放置槽与检测管盖一体成型；覆膜为ppe薄膜，覆盖在放置槽上。其中，本发明将试剂一置于检测管盖上的放置槽内，然后利用覆膜对放置槽进行封口，并将试剂二放置到检测管底部再加入封闭剂，最后盖上检测管盖，完成试剂盒的组装。气溶胶污染是困扰整个核酸扩增领域的难题，聚合酶螺旋反应扩增效率高，反应剧烈，也不免会产生带有大量扩增生产的核酸，将气溶胶污染封闭剂在反应前加入到反应管中，反应过程中熔化成液体覆盖反应液，阻止了气溶胶的挥发，并且对扩增反应无影响，反应完成后会再次凝结成固体，永久封闭反应液，杜绝了污染。本发明中，加速引物if、ib比主引物ft、bt用量减半的目的是为了让主引物先与靶序列结合，并评价加速引物数量对反应的影响。试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用裂解液对待检测样品进行加热裂解，提取dna；(2)将步骤(1)裂解后的样品液加入所述试剂盒的所述试剂一中，后与所述试剂二进行混合，同时并加入封闭液防止污染；并设置阳性和阴性对照；(3)在63-67℃的条件下，恒温扩增30-60min，显色法观察判断结果或利用浊度法进行检测。其中，本试剂盒使用时只需在试剂一上加一滴样本裂解液，并与试剂二、和封闭剂进行混合，混合后ph正好为8.8；其中样本裂解液的ph在11左右，而酶、引物、dntp为酸性物质，混合后ph约为8.8。本试剂盒使用方便，检测快速，可采用显色法判读扩增结果，解决了核酸扩增结果判断繁琐、复杂的问题。其中，显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在铜绿假单胞菌基因(阳性)，检测管颜色变为红色表示待测样本中不存在铜绿假单胞菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色为红色，则本次检测结果无效，应重新检测。显色法检测原理为：当dna聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的dna双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着psr反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的ph值降低。将ph指示剂溶液加于25μl上述psr反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液为红色。浊度法检测原理为：在psr反应过程中形成mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀，发生反应式如下:(dna)n-1+dntp→(dna)n+p2o74-p2o74-+2mg2+-→mg2p2o7↓。据此反应原理，实时浊度仪每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。形成反应曲线--s型折线，则为阳性；未形成明显反应曲线—无s型折线，则为阴性。荧光实时检测方法为：设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，此波长和sybrgreeni相同，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中，开始反应。阳性反应的表现为：在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，样本在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(tm变化范围在1-3℃之内)，此时样本可以判断为阳性。否则为阴性。如果阳性样本发生了阴性反应，或者阴性样本发生了阳性反应，应重新实验。荧光实时检测方法的原理为：核酸荧光染料可以镶嵌到dna双链里，在特定激发波长荧光激发下，可以发出荧光，进而被仪器检测到。进一步的，所述试剂盒的工作体系为：ph为8.0的所述试剂二12.5μl、所述试剂一1μl，dna模板9μl，纯水补齐25μl。进一步地，试剂一的溶剂为水和/或玻璃化液。(本发明中无特别说明的溶剂均为水)。玻璃化液选自二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇(eg)、丙二醇、丙三醇等试剂中任意2种以上的组合；或者选自efs30玻璃化液、efs40玻璃化液、edfs30玻璃化液、edfs40玻璃化液、edfsf30玻璃化液或edfsf40玻璃化液。efs30玻璃化液中含有30％v/veg，70％v/vfs溶液；efs40玻璃化液中含有40％v/veg，60％v/vfs溶液；edfs30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfs溶液；edfs40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfs溶液；fs溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解成fs溶液。edfsf30玻璃化液中含有15％v/veg，15％v/vdmso，70％v/vfsf溶液；edfsf40玻璃化液中含有20％v/veg，20％v/vdmso，60％v/vfsf溶液；fsf溶液：300g/l聚蔗糖添加0.5mol/l蔗糖，经pbs缓冲液溶解后，加20％胎牛血清后制成fsf溶液。进一步地，试剂一置于检测管盖上的放置槽内后，晾干或烘干。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种双指示剂快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，具有如下技术优点：本发明提供了一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测铜绿假单胞菌的特点，适合大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。部分试剂经玻璃化后可以室温储存运输，不依赖冷链运输和低温保存。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本发明提供的一元包装诊断试剂瓶的结构示意图；图2附图为本发明提供的引物对构成、主引物(复合引物)、加速引物构成及位置示意图；图3附图为本发明提供的加速引物对psr扩增效率的影响曲线图；其中曲线1为同时用if和ib；2为只用if；3为只用ib；4为不用加速引物；图4附图为甜菜碱浓度对检测的影响；1-7分别为0.5-1.1m甜菜碱在反应体系中的工作浓度；图5附图为本发明提供的颜色指示剂的添加对浊度法检测的影响；其中阳性组为以铜绿假单胞菌dna为模板，阴性对照组为以纯水为模板；1为不加入指示剂的阳性组；2为加入指示剂阳性组；3为不加入指示剂阴性对照组；4为加入ph指示剂阴性对照组；图6附图为本发明提供的添加指示剂利用显色法检测的结果；其中阳性组为以铜绿假单胞菌dna为模板，阴性对照组为以纯水为模板；1为不加入指示剂的阳性组；2为加入指示剂阳性组；3为不加入指示剂阴性对照组；4为加入ph指示剂阴性对照组；图7附图为本发明提供的不同ph的检测样本对显色法检测的影响；其中1为铜绿假单胞菌液；2-5：为ph分别为4、6、8、10的铜绿假单胞菌液；6为chelex裂解液代替铜绿假单胞菌液；图8附图为本发明提供的检测试剂盒用显色法特异性及适用性实验结果图；图9附图为本发明提供的检测试剂盒用荧光法检测样本适用性实验结果图；红色曲线为阳性组，紫色曲线为阴性组；图10附图为本发明提供的检测试剂盒用荧光法特异性实验结果图；a与b，阳性组，铜绿假单胞菌菌液检测呈s形曲线，结果为阳性；c.d.e.f.g，分别为其他菌检测(大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、金葡菌)，无扩增曲线，结果为阴性；h,阴性对照组,水检测无扩增曲线，结果为阴性。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1引物设计根据ncbi(referencesequence:nc_002516.2)公开的铜绿假单胞菌toxa基因序列，基于酶的链置换活性原理，设计一种快速检测铜绿假单胞菌的特异性引物对，引物对的核苷酸序列如下：ft：5’-gcatcgtcttcggcggggtggagcgcggctatgtgt-3’；seqidno.1；bt：5’-gcatcgtcttcggcggggttcgggttcctggtcctg-3’；seqidno.2。本实施例中chelex-100、甜菜碱，sigma公司；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、edta、硫酸铵，国药集团化学试剂有限公司；tris-hcl，上海生科生物科技有限公司；tritonx-100，北京美莱博医学科技有限公司；dntp，pharmacia公司；np-40，fluka公司；2×tapmix试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，amresco公司。本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，如图1其中，试剂瓶设有检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，覆盖在检测管1的开口端，封闭检测管1，其中检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为ppe薄膜，覆盖在放置槽4上。其中，本发明试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，然后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将不具有热敏成分的试剂二12.5μl放置到检测管1底部，再加入纯水2.5μl和封闭剂石蜡一滴，最后盖上检测管盖3，完成组装。其中试剂一包含10u不含甘油的bstdna聚合酶、50μm的ft、bt引物、10mmdntp和指示剂；其中试剂二为12.5μl反应体系包括(nh4)2so420mm；kcl100mm；mgso416mm；tween200.2％；甜菜碱1.6m；最后用1％koh溶液调节ph至8.0。利用ft和bt引物对配制成反应检测体系。分别取两个阳性反应扩增产物(9μl)，将阳性反应扩增产物9μl滴加在试剂一上，扣上检测管盖3，倒置约10秒。设置阴性对照(双蒸水)。分别拿起实验组和阴性对照组检测管1，将检测管盖3上的液体用力甩至管底内。将检测管置于实时浊度仪中65℃反应60min，同时利用nanodrop1000测其dna浓度，其dna浓度达到200ng/μl。本实施例用天根生化科技(北京)有限公司出品的普通pcr产物纯化试剂盒纯化，具体步骤见说明书，最后用50μl去离子水洗脱，用nanodrop1000测其dna浓度，其dna浓度达到165ng/μl。用于纯化的扩增产物为20μl，最终洗脱液为50μl，回收折损率大约在1.1-1.2之间，因此psr实际扩增浓度为(165+200)/2×50/20×(1.1-1.2)＝500-550ng/μl，故本实施例中的引物具有非常良好的扩增效率。实施例2加速引物的引入若只采用两条引物，出峰时间一般在50min之后，不能满足现场检测快速、灵敏的要求，引入加速引物包括if和ib，分别取在f与n、b与n之间，从5’端到3’端的方向分别与ft、bt相反，if和ib在靶序列上的位置示意图如图2。本实施例中加速引物为if：5’-aaggtgccgtggtagcc-3’；seqidno.3；ib：5’-tctatatcgccggcgatcc-3’；seqidno.4。本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中，试剂瓶设有检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，覆盖在检测管1的开口端，封闭检测管1，其中检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为ppe薄膜，覆盖在放置槽4上。其中，本发明试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，然后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将不具有热敏成分的试剂二放置到检测管1底部，再加入2.5μl纯水和封闭剂石蜡一滴，最后盖上检测管盖3，完成组装。其中试剂一包含10u不含甘油的bstdna聚合酶，50μm的ft、bt引物，50μm的if、ib引物各，10mmdntp和指示剂；其中试剂二为12.5μl反应体系包括(nh4)2so420mm；kcl100mm；mgso416mm；tween200.2％；甜菜碱1.6m；最后用1％koh溶液调节ph至8.0。利用ft、bt、if和ib引物对配制成反应检测体系，其中，取阳性反应扩增产物(9μl)，将阳性反应扩增产物9μl滴加在试剂一上。扣上检测管盖3，倒置约10秒。设置不添加if、不添加ib以及不添加加速引物的对照组。分别拿起各组检测管1，将检测管盖3上的液体用力甩至管底内。将检测管置于实时浊度仪中65℃反应60min，检测结果如图3所示。由图3可知，当两条加速引物if与ib同时被用于反应体系后，反应速率大大提高，ct值提前至20min以内，只用一条加速引物时效果不如两条加速引物明显，但也提高了反应速率。实施例3在实施例2的基础上对甜菜碱浓度进行验证。以0.1为一个间距设置0.5m到1.1m七个甜菜碱浓度(工作浓度)，考察不同甜菜碱浓度对反应ct值的影响。用浊度法检测，结果如图4所示，3号曲线(0.7m)与4号曲线(0.8m)反应出峰速率最快，但0.8m的甜菜碱浓度峰值略高于0.7m，最终将0.8m作为其最佳浓度。实施例4本实施例中，指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，包括终浓度0.08mm的甲酚红和终浓度0.02mm的苯酚红。其中苯酚红与甲酚红的指示特征如表1所示，变色范围满足psr反应前后ph值从8.8到6.0-6.5的降幅，而苯酚红与甲酚红的ph变化范围略有不同。表1苯酚红与甲酚红的ph指示特征本发明试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，然后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将不具有热敏成分的试剂二放置到检测管1底部，再加入2.5μl纯水和封闭剂石蜡一滴，最后盖上检测管盖3，完成组装。其中试剂一包含10u不含甘油的bstdna聚合酶，50μm的ft、bt引物，50μm的if、ib引物，10mmdntp和指示剂；其中试剂二为12.5μl反应体系包括(nh4)2so420mm；kcl100mm；mgso416mm；tween200.2％；甜菜碱1.6m；最后用1％koh溶液调节ph至8.0。同时设置不加指示剂的对照组。分别利用实施例2中的方法及本实施例中的上述体系对阳性反应扩增产物进行显色法和浊度法检测，并设置阴性对照，结果如图5-6。由图5-6可知，阳性反应变为黄色，这是由于发生的psr反应使得溶液中产生了大量的氢离子，使得ph值降低，而阴性对照的ph值不变，溶液为红色。且在加入甲酚红-苯酚红指示剂后，psr反应ct值并没有收到明显影响，说明ph指示剂不会抑制psr反应，且阴性对照同常规psr一样，并没有出现假阳性的现象。实施例5取5.0gchelex-100(bio-rad)和1.0mltritonx-100溶于100mlte缓冲液(tris10mm,edta1mm)中制成chelex裂解液。取铜绿假单胞菌的培养液，利用稀盐酸和koh溶液将菌液调节成不同ph，ph分别为4、6、8、10，将ph不同的培养液分别取200μl置于含2mlchelex裂解液的试管内，摇动混匀后，置于恒温扩增检测仪，90℃加热10min，获得裂解液。分别取9μl裂解液，滴加在试剂一上，后将混合物与试剂二、纯水和封闭剂进行混合，并放入检测仪中65℃反应40min取出观察颜色变化，结果如图7所示。试剂一、试剂二、纯水和封闭剂成分、用量同实施例4。由图7可知不同ph值的样本裂解上样后，显色效果一致，这说明用甲酚红-苯酚红作显色剂时，不受样本酸碱度的影响，这是由于将样本以1:10的比例加入到裂解液中时总体系的ph不会发生明显变化。实施例6本发明中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中，试剂瓶设有检测管1、检测管盖3、放置槽4和覆膜2；其中，检测管1为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖3与检测管1相适配，覆盖在检测管1的开口端，封闭检测管1，其中检测管1与检测管盖3一体成型；检测管盖3内侧设置放置槽4，放置槽4与检测管盖3一体成型；覆膜2为ppe薄膜，覆盖在放置槽4上。本发明试剂一1μl置于检测管盖3上的放置槽4内，晾干后利用覆膜2对放置槽4进行封口，并将不具有热敏成分的试剂二放置到检测管1底部，再加入纯水2.5μl和封闭剂石蜡一滴，最后盖上检测管盖3，完成组装。其中试剂一包含10u不含甘油的bstdna聚合酶，ft、bt引物各50μm，if、ib引物各50μm，10mmdntp和指示剂，溶剂为efs30玻璃化液；其中试剂二为12.5μl反应体系包括(nh4)2so420mm；kcl100mm；mgso416mm；tween200.2％；甜菜碱1.6m；最后用1％koh溶液调节ph至8.0。指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂(0.08mm甲酚红+0.02mm苯酚红)和1×水溶液的sybrgreeni(工作浓度)。检测样本主要为痰液、粪便、尿液、血液、唾液等，其中血液和粪便成分复杂且带有颜色。本实施例选用无菌棉签蘸取健康志愿者的粪便、尿液和指尖血液，其中阳性组分别为粪便+铜绿假单胞菌、尿液+铜绿假单胞菌和血液+铜绿假单胞菌。取各组检测样本100μl分别滴加1mlchelex裂解液，90℃加热10min，得到样品裂解液。分别取9μl样本裂解液至检测管盖的试剂一上，静置1min后，与试剂二、纯水和封闭剂进行混合混匀，放入检测仪中65℃反应40min取出观察颜色变化，结果如图8。粪便与尿液的阴性组颜色一致为红色，阳性组均变为黄色，粪便的阳性组略微发红，可能是粪便中的杂质会对反应有一定的影响，但不影响阴阳性的对比。加入血液后阴性组仍与纯裂解液组颜色保持一致，阳性组变为黄色，阴阳性区分明显，说明检测仪能适用于复杂样本的检测。图9为荧光法检测样本适用性实验结果，其中，尿液、粪便中添加铜绿假单胞菌，用试剂盒检测，荧光法呈s形曲线为阳性；未添加阳性对照菌的尿液、粪便，阴性对照，无扩增曲线，为阴性。实施例7验证实施例6中的试剂盒荧光检测特异性。阳性样本为铜绿假单胞菌，阴性样本为大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、金葡菌，并以水作为阴性对照。结果如表2、图10所示。表2psr扩增荧光法检测结果编号曲线样品s形曲线ct值结果判定1a铜绿假单胞菌1有7.02阳性2b铜绿假单胞菌2有6.84阳性3c大肠杆菌无/阴性4d沙门氏菌无/阴性5e志贺氏菌无/阴性6f单增李斯特菌无/阴性7g金葡菌无/阴性8h阴性对照无/阴性本发明提供了一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测铜绿假单胞菌的特点，不仅适合国境口岸现场监测，以及大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。序列表<110>中国检验检疫科学研究院<120>一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>36<212>dna<213>artificial<400>1gcatcgtcttcggcggggtggagcgcggctatgtgt36<210>2<211>36<212>dna<213>artificial<400>2gcatcgtcttcggcggggttcgggttcctggtcctg36<210>3<211>17<212>dna<213>artificial<400>3aaggtgccgtggtagcc17<210>4<211>19<212>dna<213>artificial<400>4tctatatcgccggcgatcc19当前第1页12