美味牛肝菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法。

背景技术：

近代科学证明食药用菇类可以用于癌症的治疗是始于1957年牛肝菌(boletusedulis)提取物具有抗癌活性的报道。自此之后，食药用菇类抗癌活性的药理研究已持续了半个多世纪，现在已有商品化的食药用菇类来源抗癌药物，如来自猪苓、香菇、云芝、树舌和灵芝的多糖等。近年来，国内外学者也开始对食药用菇类活性蛋白开展研究，并分离获得活性蛋白100余种，按其活性分类为凝集素(lectin)、核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein,rip)、免疫调节蛋白(fungalimmunomodulatoryproteins,fip)、核酸酶(nuclease)等。其中，一些蛋白表现出了巨大的抗肿瘤潜质。

美味牛肝菌boletusedulis俗称白牛肝菌、大脚菇、大腿蘑、大脚蘑、黄荞巴、网纹牛肝菌、炒菌，属真菌界(fungi)，担子菌亚门(basidiomycotina)，层菌纲(hymenomycetes)，伞菌目(agaricales)，牛肝菌科(boletineae)，牛肝菌属(boletus)。美味牛肝菌味鲜美且营养丰富，含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸及多种微量元素和维生素。据现代研究表明，美味牛肝菌具有提高人机体免疫功能，降低机体耗氧量，增加血红蛋白载氧能力，降血脂，具有抗癌作用；美味牛肝菌含有多种生物碱，可治腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐等症，经常食用牛肝菌可明显增强机体免疫力、改善机体微循环。美味牛肝菌目前尚未实现人工栽培子实体，但可利用菌丝进行深层发酵培养。

目前，除了对美味牛肝菌boletusedulis生长特性，栽培技术的研究外，对其生物活性成分的研究较少，主要是从其粗体物和多糖这2方面来进行研究。早于1957年，lucase.h(lucase.h.,antibioticsandchemotherapy,1957,7,1)首次研究并报道了美味牛肝菌能够发挥抗肿瘤作用。随后，唐微对美味牛肝菌的子实体进行粗多糖提取，并对抗s-180肿瘤的作用(唐微，西南师范大学报,1999,24(4):475-481)进行研究探讨，测得多糖含量：73.21％，蛋白质含量：7.14％。将粗多糖腹腔注射作用于荷s-180小鼠，研究结果表明美味牛肝菌多糖能够使胸腺的质量与脾脏等免疫器官质量得以显著的增加，并且可促进机体的免疫功能，小鼠外周血中白细胞的总数通过美味牛肝菌多糖作用得以提高，显著提高红细胞中sod酶活性，并能够使小鼠脾淋巴细胞的转化功能得以提升。并且对于s-180荷瘤小鼠的生命具有一定的延长作用，对s-180具有显著性的抗肿瘤作用。李志洲(李志洲.研究报告,2009,35(2):49-51)对美味牛肝菌子实体提取多糖的抗氧化作用进行研究，试验采用羟基自由基体系和超氧阴离子自由基体系，试验中与vc做参照物进行对比。结果表明，美味牛肝菌多糖能够有效的清除自由基，并且其清除自由基能力与多糖浓度之间显现了正相关关系。李娜(李娜.中国食物与营养,2010,45(3)73-76)研究了美味牛肝菌多糖对小鼠负重游泳时间及血清中血糖(lg)、尿素氮(bun)、乳酸脱氢酶(ldh)的影响。结果表明美味牛肝菌多糖不仅能延长小鼠游泳时间，提高lg含量，也能降低bun含量、提高ldh活性。这表明，美味牛肝菌具有抗疲劳作用。总的来说，目前对boletusedulis的组成或营养成分及其药用价值研究较少，尤其是对于boletusedulis中含量丰富的生物活性蛋白研究更少，仅有bovim等(glycobiology.2013may；23(5):578-92.)对其蛋白方面做了部分研究，他们的研究表明此美味牛肝菌的蛋白bel具有凝集素活性。而本发明从boletusedulis中分离纯化得到一种未发现过的具有抗肿瘤活性的蛋白。

技术实现要素：

本发明目的在于提供美味牛肝菌boletusedulis中一种抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法，该蛋白提取物对人肺腺癌细胞株a549的生长具有明显的抑制作用。

本发明涉及的美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物beap是按照如下方法制备的：

1)将美味牛肝菌子实体35～55℃烘干并研磨成粉，溶解于0.2～0.5m的nacl溶液中，23～28℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；

2)向上清液中加入nh4so4至饱和度为60～80％，2～6℃放置8～16小时，10000～20000rpm离心10～40min，收集沉淀，即得美味牛肝菌蛋白粗提物；

3)将美味牛肝菌蛋白粗提物用10～50mm、ph6.0～8.0的tris-hcl缓冲液溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的该缓冲液中透析38～50小时，反复3～5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得美味牛肝菌蛋白粗粉；

4)将美味牛肝菌蛋白粗粉溶解于10～50mm、ph6.0～8.0的tris-hcl缓冲液中，上样于强阴离子层析柱，用0-1mol/lnacl线性洗脱，收集洗脱峰；

5)将0.35mol/lnacl洗脱峰组分上样于弱阴离子层析柱，用10～50mmtris-hcl、0-1mol/lnacl，ph6.0～8.0缓冲液线性洗脱，收集第二个洗脱峰。

6)将0.65mol/lnacl洗脱峰组分再次上样于弱阴离子层析柱，用10～50mmtris-hcl、0.2mol/lnacl、0.225mol/lnacl、0.25mol/lnacl，ph6.0～8.0缓冲液依次洗脱，收集0.225mol/lnacl洗脱峰，获得美味牛肝菌抗肿瘤蛋白提取物。进一步的，步骤1)中美味牛肝菌子实体粉与nacl溶液的料液比为1:10。

本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物采用sds-page进行纯度检测，证明其是分子量为16.76kda的蛋白，esi-ms/ms法测得其氨基酸序列与意大利美味牛肝菌的凝集素蛋白boletusedulislectin(15.98kda)f2z266有18％的相似度。

本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物对人肺腺癌细胞株a549的生长具有明显的抑制作用，annexinv-fitc/pi双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。

将上述美味牛肝菌boletusedulis中抗肿瘤蛋白提取物命名为beap(boletusedulisanticancerprotein)。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础；(3)本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物具有良好的抗肿瘤效果；(4)本发明中美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物制备简单，成本低，适于大规模生产。

附图说明

图1本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物的强阴离子交换层析图；

图2本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物的弱阴离子交换层析图；

图3本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物的弱阴离子交换层析图；

图4本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物的sds-page图(1：粗品2：q13：qd24:beap)；

图5本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物的氨基酸序列与意大利美味牛肝菌的凝集素蛋白boletusedulislectin(15.98kda)f2z266的比对；

图6本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物对a549细胞生长的抑制作用；

图7本发明boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用(图7a.未加抗肿瘤蛋白提取物的a549细胞；图7b.25ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞；图7c.50ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞；图7d.75ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞)。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。所述的美味牛肝菌boletusedulis可从云南省昆明市当地市场获得。意大利美味牛肝菌的凝集素蛋白boletusedulislectin(15.98kda)f2z266的详细信息在ncbi数据库的蛋白质库的登记号是f2z266，版本号是gi:357580535。

实施例1本发明美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物beap的制备

(1)将美味牛肝菌boletusedulis子实体45℃烘干并研磨成粉，浸泡于0.5m的nacl溶液，料液比为1:10，23℃浸提12小时，6000rpm离心10min，收集上清液；

(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃放置12小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物；

(3)将美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物用10mm、ph7.0的tris-hcl缓冲液溶解，然后在4℃、5倍重量的该tris-hcl缓冲液中透析48小时，其中反复5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗粉；

(4)将美味牛肝菌蛋白粗粉溶解于10mm、ph7.0的tris-hcl缓冲液中，上样于强阴离子层析柱，用0-1mol/lnacl线性洗脱，收集洗脱峰q1，参见附图1。

(5)将0.35mol/lnacl洗脱峰组分上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0-1mol/lnacl，ph7.0缓冲液线性洗脱，收集第二个洗脱峰qd2，参见附图2。

(6)将0.65mol/lnacl洗脱峰组分再次上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0.2mol/lnacl、0.225mol/lnacl、0.25mol/lnacl，ph7.0缓冲液依次洗脱，收集0.225mol/lnacl洗脱峰，获得美味牛肝菌抗肿瘤蛋白提取物，参见附图3。

实施例2本发明美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物beap的制备

(1)将美味牛肝菌boletusedulis子实体35℃烘干并研磨成粉，浸泡于0.2m的nacl溶液，料液比为1:10，25℃浸提8小时，4000rpm离心20min，收集上清液；

(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为60％，2℃放置16小时，12000rpm离心10min，收集沉淀，即美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物；

(3)将美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物用50mm、ph6.0的tris-hcl缓冲液溶解，然后在4℃、5倍重量的该tris-hcl缓冲液中透析38小时，其中反复5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗粉；

(4)将美味牛肝菌蛋白粗粉溶解于10mm、ph7.0的tris-hcl缓冲液中，上样于强阴离子层析柱，用0–0.4mol/lnacl线性洗脱，收集洗脱峰q1，参见附图1。

(5)将0.35mol/lnacl洗脱峰组分上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0-1mol/lnacl，ph7.0缓冲液线性洗脱，收集第二个洗脱峰qd2，参见附图2。

(6)将0.65mol/lnacl洗脱峰组分再次上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0.2mol/lnacl、0.225mol/lnacl、0.25mol/lnacl，ph7.0缓冲液依次洗脱，收集0.225mol/lnacl洗脱峰，获得美味牛肝菌抗肿瘤蛋白提取物，参见附图3。

实施例3本发明美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物beap的制备

(1)将美味牛肝菌boletusedulis子实体55℃烘干并研磨成粉，浸泡于0.4m的nacl溶液，料液比为1:10，28℃浸提16小时，8000rpm离心15min，收集上清液；

(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，4℃放置8小时，20000rpm离心10min，收集沉淀，即美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物；

(3)将美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗提物用20mm、ph8.0的tris-hcl缓冲液溶解，然后在4℃、5倍重量的该tris-hcl缓冲液中透析48小时，其中反复5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得美味牛肝菌boletusedulis蛋白粗粉；

(4)将美味牛肝菌蛋白粗粉溶解于10mm、ph7.0的tris-hcl缓冲液中，上样于强阴离子层析柱，用0-0.4mol/lnacl线性洗脱，收集洗脱峰q1，参见附图1。

(5)将0.35mol/lnacl洗脱峰组分上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0–0.7mol/lnacl，ph7.0缓冲液线性洗脱，收集第二个洗脱峰qd2，参见附图2。

(6)将0.65mol/lnacl洗脱峰组分再次上样于弱阴离子层析柱，用10mmtris-hcl、0.2mol/lnacl、0.225mol/lnacl、0.25mol/lnacl，ph7.0缓冲液依次洗脱，收集0.225mol/lnacl洗脱峰，获得美味牛肝菌抗肿瘤蛋白提取物，参见附图3。

实施例4本发明抗肿瘤蛋白提取物的氨基酸序列测定

(1)sds-page电泳：12％胶浓度，加预染marker，上样15μg，上样量10μl；

(2)电泳结束后，用考马斯亮蓝r-250染色30min，随即用脱色液进行脱色；

(3)脱色结束后，将目的条带切下并置于洁净1.5ml离心管中，用蒸馏水清洗3次后，加入1ml胶内脱色液(50％乙腈，25mmnh4hco3)脱色10min，弃去脱色液，重复2次；

(4)加入乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈；

(5)向管内加10mmdtt，让胶粒吸收完全，放入56℃水浴锅内，孵育1h；

(6)孵育完毕后，移除多余dtt液体，加入55mmiam，暗室室温孵育45min；

(7)孵育完毕后，移除多余iam液体，加入25mmnh4hco3，清洗10min，并重复清洗一次；

(8)移除nh4hco3，加入脱色液清洗10min，并重复一次。

(9)乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。

(10)1μg/μl的胰蛋白酶储液以25mmnh4hco3稀释15倍，加入脱水后的胶粒中，让胶粒充分吸收。然后加入25mmnh4hco3没过胶粒，放入37℃水浴锅，消化过夜。

(11)过夜后，加入终浓度0.1％的fa终止消化。

(12)取10μl样品上hplc，使用质谱仪检测。

如图4，esi-ms/ms测得本发明美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物beap的氨基酸序列与意大利美味牛肝菌的凝集素蛋白boletusedulislectin(15.98kda)f2z266有18％的相似度，参见附图5。

实施例5本发明抗肿瘤蛋白提取物对a549细胞的抗增殖作用

(1)将a549细胞按1×10⁴cfu/孔的浓度接种于96孔板中，37℃培养24小时；

(2)每孔加入10μl用培养基依次梯度稀释的浓度为7.8ug/ml、15.6ug/ml、31.25ug/ml、62.5ug/m、125ug/ml、250ug/ml的抗肿瘤蛋白提取物，每个浓度3个平行，并设空白对照，37℃培养48h。

(3)每孔加入25μl预冷的50％三氯乙酸溶液，4℃放置1h；

(4)蒸馏水洗涤5次，室温干燥后每孔加入100μlsrb染液(srb4g/l，1％乙酸)染色30min；

(5)1％乙酸溶液洗涤5次，室温干燥后每孔加入150μl，10mmol/ltris缓冲液，用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光值。

该蛋白提取物对a549细胞的抗增殖作用如图6，beap处理a549细胞48小时后对a549细胞抗增殖作用明显。

实施例6本发明抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

(1)将a549细胞按1×10⁵cfu/孔的浓度接种于6孔板中，37℃培养24小时后加入相同体积的beap溶液，使之终浓度为25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml；

(2)孵育48小时后，用不含edta的胰酶消化液消化细胞，消化时间不宜过长，终止消化后将细胞悬液加至相应的离心管，1000rpm离心3min，弃培养基；

(3)用3ml预冷的pbs洗涤两次；1000rpm离心3min，弃上清，重复2次；

(4)用预冷的bindingbuffer轻轻悬浮细胞至5×10⁵～1×10⁶cfu/ml；

(5)取0.5ml细胞悬液至流式细胞管内，加入5μlannexinv-fitc混匀后，避光，室温温育15min；

(6)加入5μlpi；

(7)过200目细胞筛后上流式细胞仪检测。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。通过fitc单阳和双阳染色可以很容易地将磷脂酰丝氨酸(ps)外翻的细胞(即凋亡细胞)和正常细胞(双阴)、坏死细胞(pi单阳)区分开来。图7是a549细胞用annexinv-fitc/pi染色经流式细胞仪检测的结果，其中图7a为未加抗肿瘤蛋白提取物的a549细胞；图7b为25ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞；图7c为50ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞；图7d为75ug/ml抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞，其象限图中的右象限代表annexinv-fitc染色的细胞，即凋亡细胞。25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物处理的a549细胞，凋亡细胞的比率分别为20％、24.6％、40.5％。从图中可以看出随着美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物浓度的增加，凋亡细胞的比率逐渐增加，表明本发明的美味牛肝菌boletusedulis抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡具有诱导作用。