一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。

背景技术：

磷是植物生长所必须的营养元素之一，参与植物体内大部分的新陈代谢过程。然而，环境中的磷通常以磷酸钙盐的形式存在，不能被植物直接吸收和利用，导致大部分耕地严重缺磷。由于磷是不可再生的矿质资源，土壤中磷含量不足已成为制约农作物产量的重要因素。因此，农业生产上通常以施用磷肥的方式来解决上述问题。但是，磷肥进去土壤后，大部分磷会淋失、挥发或者与土壤中的ca⁺、fe³⁺、al³⁺等离子结合形成难溶的磷酸盐，作物仍然无法吸收利用，导致磷肥的利用率仅有20%左右。

微生物对土壤中磷利用率的影响作用较大，解磷菌能够将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性有效磷，供植物吸收利用。

技术实现要素：

本发明的目的是为基于上述现有技术状况，提供一株基于自主分离筛选的高效解磷假单胞菌及其应用，本发明筛选得到的解磷菌1416x3，其原始解磷能力为741mg/l，优化其生长的无机磷发酵培养基初始ph和培养温度后，其解磷能力可达793mg/l，将该菌制成微生物菌剂，利用解磷菌剂和肥料的共同作用来促进植物生长，可增加作物产量，提高土壤中磷的有效利用率，改善土壤质量，对农业、经济和环境具有非常重要的意义。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的：

以磷酸钙作为控制磷源，采用平板筛选法从太湖沉积物样品中初筛得到12株具有溶磷圈的细菌，再采用摇瓶培养法复筛，得到一株高效解磷的假单胞菌1416x3，该菌的菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性。该菌株已于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其菌种保藏号为cgmccno.17557。

利用上述假单胞菌1416x3生产微生物菌剂的方法如下：

1）将上述假单胞菌1416x3接种于lb液体培养基中，培养至对数生长期（菌量约10⁸cfu/ml），震荡培养；培养条件为温度25-30℃、转速150-200rpm，500ml三角瓶装液量150-250ml，培养时间24-36h；

所述lb培养基成分组成为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。

2）按照1-5%接种量将培养好的种子液接种于含有磷酸钙的无机磷液体培养基中，初始ph7.0-7.2，温度25-30℃，转速150-200rpm，发酵24-36h；

所述无机磷发酵培养基成分组成为：葡萄糖15g/l，mgcl2·6h2o5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，kcl0.2g/l，(nh4)2so40.2g/l，ca3(po4)25g/l，ph7.0-7.2，115℃灭菌30min。

3）发酵结束后，培养液罐装成微生物菌剂。培养液中可溶性磷含量可达793mg/l，解磷效果显著。

本发明所提供的菌株丰富了解磷菌菌种资源，减少了磷肥的用量，改善了土壤肥力、提高了农作物产量，降低了环境污染，应用前景广阔。

附图说明：

图1不同培养温度和初始ph值对假单胞菌1416x3的影响。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述，但不限于下列实例。

实施例1：解磷菌的筛选和溶磷能力测定

采用十倍梯度稀释法从湖水沉积物样品中分离筛选到一株解磷菌，申请人将其命名为1416x3，该菌的菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性，经16srrna基因测序确定细菌1416x3为假单胞菌属（pseudomonassp.）。

将菌株1416x3接入lb液体培养基，28℃、150rpm振荡培养24h后。分别接种2ml种子液于装有100ml无机磷液体培养基的250ml三角瓶中，以不加任何菌的培养基作为空白对照，每个处理三个重复，28℃、150rpm振荡培养5天，每24h取培养液，10000rpm离心10min，取上清液，用钼锑抗比色法测定其可溶性磷含量，结果表明菌株1416x3的解磷能力为741mg/l。

其中，无机磷培养基组成为：葡萄糖15g/l，mgcl2·6h2o5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，kcl0.2g/l，(nh4)2so40.2g/l，ca3(po4)25g/l，ph7.0-7.2，115℃灭菌30min。

其中，lb培养基组成为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph7.0-7.2，固体培养基加15g琼脂，121℃灭菌20min。

实施例2：解磷菌的发酵方法

（1）种子扩大培养：从斜面上取1-2环假单胞菌1416x3的菌苔，接种于已灭菌的lb液体培养基中震荡培养；培养条件为温度25-30℃、转速150-200rpm，500ml三角瓶装液量150-250ml，培养时间24-36h，其中，lb培养基成分组成为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph7.0-7.2，固体培养基加15g琼脂，121℃灭菌20min。

（2）发酵培养：将上述种子液，以1-5%接种量（w/w）接入无机磷发酵培养基中，温度25-30℃，转速150-200rpm，发酵时间24-36h；无机磷培养基成分组成为：葡萄糖15g/l，mgcl2·6h2o5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，kcl0.2g/l，(nh4)2so40.2g/l，ca3(po4)25g/l，ph7.0-7.2，115℃灭菌30min。

（3）发酵结束后，培养液罐装成菌剂。

实施例3：不同培养温度和初始ph值对假单胞菌1416x3的影响

将假单胞菌1416x3接入lb液体培养基上，28℃、150rpm振荡培养24h。取2ml培养好的假单胞菌1416x3种子液，接种于含有100ml无机磷液体培养基的250ml三角瓶中，以未接菌的培养液作为对照，分别在20℃、28℃、37℃、40℃条件下，150rpm振荡培养5天，每个处理重复3次，每24h取发酵液，10000rpm离心10min，取上清液，用钼锑抗比色法测定有效磷的含量，结果如图1所示。结果表明（图1），假单胞菌1416x3在28℃时解磷效果最好，优化培养温度后，其溶磷量从原来的741mg/l增加到758mg/l。

初始ph条件优化时，分别将无机磷液体培养基的ph值调为6、6.5、7、7.5、8，其他条件保持恒定。结果表明（图1），假单胞菌1416x3在ph值为7时解磷效果最好，优化无机磷液体培养基的初始ph值后，其溶磷量进一步增至793mg/l。

实施例4：解磷菌的应用

采集郑州市郊区农田中土壤（0-20cm），去除杂质。将30g土壤加入95ml无菌水中，并接种5ml假单胞菌1416x3的种子液，同时以接种5ml灭活的假单胞菌1416x3的种子液，作为对照，常温条件下，静置，每24h取上清液，采用钼锑抗比色法测定其可溶性有效磷的含量。结果显示，与对照组相比，在假单胞菌1416x3的作用下，土壤可溶性有效磷含量提高了24%。