一种细胞核穿透肽及其用途的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞核穿透肽及其用途。

背景技术：

细胞核是真核细胞中的封闭式、膜状细胞器，细胞核含有细胞中大多数的遗传物质。其主要构造为核质和核膜，前者主要是dna与蛋白质等物质，后者是一种将双层膜使其与胞质相分隔。大多数分子无法直接穿透核膜，所以如何介导外源物质递送至细胞核一直是细胞生物学的研究热点之一。

细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,cpps)，或称穿透肽，是一类能高效携带大分子物质进入细胞的短肽。部分穿膜肽不但可以穿透细胞膜，还可以穿透核膜，实现高效的物质递送，同时又可以通过人工序列设计，使兼具靶向性和无毒性。所以细胞核递送过程中细胞核穿透肽是最理想的载体之一。

技术实现要素：

本发明提供一种新的细胞核穿透肽，该细胞核穿透肽可穿透核膜，进入核仁。

本发明的细胞核穿透肽采用如下技术方案：一种细胞核穿透肽，所述细胞核穿透肽的氨基酸序列为：lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys。

本发明还提供了一种复合物，具体技术方案为：所述复合物包括如上所述的细胞核穿透肽和外源物质。例如，复合物中的细胞核穿透肽可通过共价或非共价键与外源物质相连，以便于实现可将外源物质运送至细胞核中的目的。

优选的，所述外源物质为货物分子和/或标记分子。

优选的，所述货物分子为核苷酸和/或药物分子前体；所述标记分子为荧光素和/或生物素。

本发明还提供了如上所述的细胞核穿透肽的用途，具体技术方案为：所述细胞核穿透肽在介导外源物质进入细胞核中的应用。

优选的，所述细胞核穿透肽在介导外源物质进入细胞核核仁中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的细胞核穿透肽可穿透核膜进入细胞核核仁。

本发明的细胞核穿透肽仅含8个氨基酸，无细胞毒性和免疫原性，安全性好。

本发明的细胞核穿透肽采用技术成熟的多肽固相合成方法的合成，便于质量管控，廉价易得。

用fitc对本发明的细胞核穿透肽进行荧光标记后，将其与贴壁细胞共培养，测得的细胞核内的荧光量可达仅将fitc与贴壁细胞共培养组的76倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3的荧光显微镜观察图，图1(a)为fitc组的荧光显微镜观察图，图1(b)为fitc荧光标记细胞核穿透肽组的荧光显微镜观察图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1合成本发明的细胞核穿透肽

1)活化树脂：称取1000mgfmoc-trpwangresin，加入30mldmf浸泡30min，使其充分溶胀。

2)脱保护：抽滤除去浸泡树脂的30mldmf，加入含质量百分比为20％哌啶的dmf溶液30ml，氮气吹沸25min，然后抽滤除去，用10ml异丙醇和dmf交替洗涤树脂三次，而后用茚三酮法检测树脂，树脂应成黑色或紫色。

3)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取1.4mmol/g树脂的fmoc-氨基酸，以tbtu/hobt/diea的30mldmf为反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应后，用10ml异丙醇和dmf交替洗涤树脂三次。检测氨基。

4)重复步骤2)-3)过程：按多肽的顺序自c端向n端延伸多肽。多肽序列为：lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys。

5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按tfa/phenol/超纯水/thioanisole/edt/tis(80/5/5/5/3/2，体积比)的比例配成30ml混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2h，砂芯过滤器除去树脂，滤液直接滴入冷冻乙醚中，5000r/min离心沉淀，冻干至恒重即得粗肽。

6)粗肽用hplc纯化，纯化条件为10％至100％的乙腈梯度洗脱30分钟，产物纯度为97％。得到纯化后的多肽，多肽序列为：lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys。

实施例2细胞毒性实验

1)取48孔板，每孔加入含有5×10⁴个宫颈癌hela细胞培养液，37℃，5％二氧化碳培养箱24小时至细胞贴壁。

2)配置含1mm浓度的细胞核穿透肽(lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys)的培养基，以无细胞核穿透肽的培养基为阴性对照孔(control)，37℃，5％二氧化碳培养48h。培养基配方为：含10％胎牛血清的dmem培养基。

3)贴壁细胞每孔加入20μlmtt，继续孵育4h之后弃掉培养液，每孔加入150μldmso，振荡10min。

4)选择490nm波长，在酶标仪免疫检测仪上通过光吸收值计算细胞存活率。

表1本发明的细胞核穿透肽的毒性测试

由表1可知，本发明的细胞核穿透肽在高浓度(1mm)条件下长时间(48h)培养对细胞存活率没有明显影响，本发明的细胞核穿透肽安全无毒。

实施例3本发明的细胞核穿透肽穿膜入核荧光检测试验

1)在贴壁细胞中分别加入含有一定浓度fitc和fitc荧光标记的细胞核穿透肽(lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys)的培养基，孵育0.5min后小心吸去培养基，并肝素-pbs洗涤贴壁细胞三次。培养基配方为：含10％的dmem培养基。

2)在荧光显微镜下进行拍照(详见说明书附图图1，图1(a)为fitc组的荧光显微镜观察图，图1(b)为fitc荧光标记细胞核穿透肽的荧光显微镜观察图)。

由图1可知，本发明的细胞核穿透肽能够有效进入核仁(图中亮斑)。

实施例4本发明的细胞核穿透肽进入细胞核的荧光量测试

1)在贴壁细胞中分别加入含有一定浓度fitc、fitc荧光标记的细胞核穿透肽(lys-lys-arg-pro-pro-arg-lys-lys)、fitc荧光标记的参照肽1(glu-lys-arg-pro-pro-arg-lys-glu)和fitc荧光标记的参照肽2(lys-lys-arg-asp-asp-arg-lys-lys)的培养基，孵育30min-4h后小心吸去培养基，并pbs洗涤贴壁细胞三次。培养基配方为：含10％的dmem培养基。

2)加入胰酶反应5min至细胞浮起，再加入新鲜培养基中止反应。

3)在流式细胞仪中测定10000个细胞具有的荧光量。以fitc为对照和参比(100％)。

表2细胞核穿透肽进入细胞核的荧光量测试

由表2可知，fitc荧光标记细胞核穿透肽组胞内总荧光量较fitc组有几何数量级增长，本发明的细胞核穿透肽可高效穿过核膜，成功将fitc带入核内，同时实验也表明氨基酸残基的替换会导致细胞核穿透肽失能，所以本发明的细胞核穿透肽的序列具有显著的独特性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南阳师范学院

<120>一种细胞核穿透肽及其用途

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

lyslysargproproarglyslys

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

glulysargproproarglysglu

15

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

lyslysargaspasparglyslys

15