一种皮肤胆固醇检测的试剂及其制备方法与流程

本发明属于化学及医学领域，具体涉及一种皮肤胆固醇检测的试剂及其制备方法。

背景技术：

皮肤胆固醇被发现可作为动脉粥样硬化早期筛查的新型标志物后，各研究团队就纷纷开始合成各种可以识别皮肤胆固醇的检测试剂，用于皮肤表皮胆固醇的无创检测，其中，基于a-c-b试剂的皮肤胆固醇测量方法应用最为成熟，由于a-c-b试剂中含有生物大分子(酶)、聚合物和小分子，合成过程比较复杂，对于每一步合成产物的质量难以控制，加以酶活性容易受到温度、ph等环境因素的影响，保存时间相对比较短。再者，a-c-b试剂检测时需要用到显色剂，对于显色时间需要严格控制，否则测量结果会差别很大，检测时间相应较长，大概需要4-5min，针对以上缺点，本团队于2017年开发了一种可以用于皮肤胆固醇无创检测的荧光检测试剂(申请公布号为cn108204963a)，虽然相比于a-c-b检测试剂的合成方法质控更容易，成分更加单一，但是，由于每一步中间体和终产物的合成反应时间太长，从而导致合成效率低下，故使其大规模的量产受到了局限；同时，由于合成的最终产物中含有酯键，长期保存水解风险较大，所以稳定性有所欠缺，不利于长期存放；再者，此种方法合成出的产物，副反应较多，纯化比较困难，导致最终纯度和产率均低于50％。所以，发展一种合成时间短、合成产率和纯度高、化学性质稳定的皮肤胆固醇检测试剂仍然迫在眉睫。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种皮肤胆固醇检测的试剂及其制备方法。

第一方面，本发明提供了一种用于皮肤胆固醇检测的试剂，其结构式如下所示：

其中r1部分为荧光基团，r2部分为水溶性的柔性链。

优选地，所述r1部分可以为末端含有羧基的任意荧光基团，r2部分的苯基可以为甲基、酯基、氰基或氢中的任意一种，r2部分链末端的氮可以为氧、硫中的任意一种。

进一步优选地，所述r1部分为7-(二乙基氨基)-2-氧-2氢-苯并呋喃-3-羧酸。

第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述用于皮肤胆固醇检测试剂的方法，包括如下步骤：

1)在催化剂和溶剂环境下，7-(二乙基氨基)-2-氧-2氢-苯并呋喃-3-羧酸、2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺发生缩合反应，生成氮-(2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-(二乙基氨基)-2-氧-2-氢-苯并呋喃-3-甲酰胺；

2)在催化剂和配体存在环境下，将洋地黄皂苷进行烷基化反应，生成(3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2氢-吡喃-4-基)氧)-6-(((1-苯丙醇-2-基-1-基)氧)甲基)四氢-2氢-吡喃-3,4,5-三醇；

3)在催化剂和溶剂环境下，将步骤1)生成的氮-(2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-(二乙基氨基)-2-氧-2-氢-苯并呋喃-3-甲酰胺和步骤2)生成的(3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2氢-吡喃-4-基)氧)-6-(((1-苯丙醇-2-基-1-基)氧)甲基)四氢-2-氢-吡喃-3,4,5-三醇发生点击化学反应。

优选地，所述步骤1)中催化剂为水溶性的碳二亚胺类化合物；步骤2)中催化剂为有机金属铜盐，所述配体为双恶唑吡啶类化合物、大位阻的硼酸类化合物；步骤3)中所述催化剂含有金属铜盐和还原性化合物。

进一步优选地，步骤1)中所述碳二亚胺类化合物为1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐；步骤2)中所述有机金属铜盐为四乙腈四氟硼酸铜或醋酸酮，所述双恶唑吡啶类化合物为2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶或联吡啶，所述大位阻的硼酸类化合物为10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇或硼酸；步骤3)中所述金属铜盐为硫酸铜或氯化亚铜，所述还原性化合物为维生素c-na或维生素c。

具体地，步骤2)中所述有机金属铜盐、双恶唑吡啶类化合物、大位阻的硼酸类化合物相对于洋地黄皂苷的比例分别为5％、10％、30％。

第三方面，本发明提供了一种第一方面所述试剂或第二方面所述方法制备的试剂在检测皮肤胆固醇中的应用。应用步骤如下所示：

1)将合成的荧光检测试剂用二甲基亚砜(dmso)配置成溶液，以用于检测皮肤胆固醇；

2)将待检测部位的皮肤胆固醇用无水乙醇萃取；

3)用无水乙醇配置不同浓度的胆固醇标准品溶液，用气相色谱法分别测量标准品溶液和萃取液中胆固醇的峰面积；

4)分析得到胆固醇标准品溶液的峰面积与浓度的标准曲线，再计算萃取液中胆固醇的浓度。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明通过采取缩合反应、烷基化反应、点击化学为主要步骤的合成方法，解决现有皮肤胆固醇检测试剂合成繁琐、反应时间长的问题，可以实现大量量产的目的；

2)本发明由于最后一步检测试剂的合成，引入了具有高度立体选择性的点击化学，该反应没有副产物，使得检测试剂的纯度和产率均大大提高，进一步保证了皮肤胆固醇检测的准确性；

3)本发明合成的试剂不含有酯键，在保存过程中不会因为水解导致试剂变质，影响检测效果。

附图说明

图1.皮肤胆固醇检测试剂结构式；

图2.皮肤胆固醇检测试剂合成第一步反应，缩合反应；

图3.皮肤胆固醇检测试剂合成第二步反应，烷基化反应；

图4.皮肤胆固醇检测试剂合成第三步反应，点击化学；

图5.标准品浓度与峰面积标准曲线；

图6.气相色谱测量的猪皮表面胆固醇含量和检测试剂检测的含量相关性；

图7.气相色谱测量的人手掌小鱼际表皮胆固醇含量和检测试剂检测的含量相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实验材料

实施例1：皮肤胆固醇检测试剂及其合成方法

本发明合成的皮肤胆固醇检测试剂结构式如图1所示，其中r1部分为末端含有羧基的任意荧光基团，r2部分的苯基可以为甲基、酯基、氰基或氢中的任意一种，r2部分链末端的n可以为氧、硫中的任意一种。

具体地，其中一种皮肤胆固醇检测试剂的中文名称为7-(二乙基氨基)-氮-(2-(2-(2-(2-(4-((((2r,3s,4s,5r)-6-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2-氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-4-基)氧)-3,4,5-三羟基四氢-2-氢-吡喃-2-基)甲氧基)(苯基)甲基)-1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氧-2-氢苯并吡喃-3-甲酰胺；英文名称为：

7-(diethylamino)-n-(2-(2-(2-(2-(4-((((2r,3s,4s,5r)-6-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-dihydroxy-5',6a,8a,9-tetramethyldocosahydrospiro[naphtho[2',1':4,5]indeno[2,1-b]furan-10,2'-pyran]-4-yl)oxy)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydro-2h-pyran-3-yl)oxy)-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2h-pyran-2-yl)oxy)tetrahydro-2h-pyran-3-yl)oxy)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2h-pyran-4-yl)oxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2h-pyran-2-yl)methoxy)(phenyl)methyl)-1h-1,2,3-triazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-oxo-2h-chromene-3-carboxamide。

具体该检测试剂的合成方法包括以下步骤：

1)缩合反应：

反应化学方程式如图2所示，将7-(二乙基氨基)-2-氧-2氢-苯并呋喃-3-羧酸(1.3g,5.0mmol)、2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺(1.2g,5.5mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入二环己基碳二亚胺(dcc)(1.24g,6.0mmol)、1-羟基苯并三唑(hobt)(0.81g,6.0mmol)、二异丙基乙基胺(diea)(1.94g,15.0mmol)，室温搅拌过夜，将n,n-二甲基甲酰胺(dmf)旋干，加入水，二氯甲烷(dcm)萃取三次，合并有机层后依次用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇＝30:1)，得到氮-(2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-(二乙基氨基)-2-氧-2-氢-苯并呋喃-3-甲酰胺，产率95％。

2)烷基化反应：

反应化学方程式如图3所示，将洋地黄皂苷(0.62g,0.5mmol)、叔丁基(1-苯丙基-2-氧-1-炔)碳酸酯(146mg,0.6mmol)、四乙腈四氟硼酸铜(8mg,0.025mmol)、2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶(13mg,0.05mmol)、10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇(31mg,0.015mmol)和分子筛(0.4g)置于n2保护的两口反应瓶中，加入三乙胺(101mg,1.0mmol)和四氢呋喃(thf)(4ml)，常温下搅拌9小时，反应液过滤(垫上硅藻土)，四氢呋喃(thf)洗涤三次，滤液在旋转蒸发仪旋蒸，得到棕黄色固体(有一定粘性)，再往其中加入(石油醚/乙酸乙酯)，超声20分钟，待固体完全分散后过滤，固体完全干燥后称重，得棕色固体(3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2-氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-4-基)氧)-6-(((1-苯丙醇-2-基-1-基)氧)甲基)四氢-2-氢-吡喃-3,4,5-三醇，产率85％。

3)点击化学

反应化学方程式如图4所示，将氮-(2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-(二乙基氨基)-2-氧-2-氢-苯并呋喃-3-甲酰胺(88mg,0.19mmol)和(3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2-氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-4-基)氧)-6-(((1-苯丙醇-2-基-1-基)氧)甲基)四氢-2-氢-吡喃-3,4,5-三醇(250mg,0.19mmol)溶于四氢呋喃中，加入维生素c-na(38mg,0.19mmol)，再加入硫酸铜(31mg,0.19mmol)(溶于水中)，常温搅拌1h，反应液置于旋转蒸发仪上旋干，得棕色油状物，加入四氢呋喃，超声10分钟后过滤，滤液旋干后得到棕色固体，再加入(石油醚：乙酸乙酯)，超声20分钟后过滤，干燥得到7-(二乙基氨基)-氮-(2-(2-(2-(2-(4-((((2r,3s,4s,5r)-6-(((3r,4s,5s,6r)-2-(((3r,4s,5r,6r)-2-(((2r,3r,4r,5r)-6-(((2as,2'r,4r,5r,5'r,6as,6bs,8as,8br,9s,11ar,12s,12as,12br)-5,12-二羟基-5',6a,8a,9-四甲基二十二碳[萘并[2',1':4,5]茚并[2,1-b]呋喃-10,2'-吡喃]-4-基)氧)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-5-羟基-6-(羟甲基)-4-(((2s,3r,4s,5r)-3,4,5-三羟基四氢-2-氢-吡喃-2-基)氧)四氢-2-氢-吡喃-3-基)氧)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-基)甲氧基)(苯基)甲基)-1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氧-2h-苯并吡喃-3-甲酰胺，产率100％。

实施例2：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施例1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为35％。

实施例3：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施例1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为57％。

实施例4：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为20％。

实施例5：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施例1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为27％。

实施例6：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施例1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为20％。

实施例7：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施例1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，其他与实施例1相同，烷基化反应产率为20％。

实施例8：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同，点击化学反应产率为99％。

实施例9：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，点击化学反应产率为90％。

实施例10：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同,点击化学反应产率为89％。

实施例11：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施1相同,烷基化反应和点击化学反应产率为35％。

实施例12：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为33％。

实施例13：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为33％。

实施例14：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为36％。

实施例15：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为52％。

实施例16：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学中的的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为52％。

实施例17：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例18：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例19：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同,烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例20：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学的的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同,烷基化反应和点击化学反应产率为27％。

实施例21：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为26％。

实施例22：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为25％。

实施例23：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例24：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例25：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的四乙腈四氟硼酸铜换成醋酸铜，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例26：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例27：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例28：皮肤胆固醇检测试剂的合成方法

本实施方式与实施1不同的是：烷基化反应中的2,6-双((s)-4-甲基-4,5-二氢恶唑-2-基)吡啶换成联吡啶，10-氢-二苯并[b,e][1,4]氧硼-10-醇换成硼酸，点击化学中的硫酸铜换成氯化亚铜，维生素c-na换成维生素c，其他与实施例1相同，烷基化反应和点击化学反应产率为20％。

实施例29：皮肤胆固醇含量的检测

以上实施例1至实施例28所合成的皮肤胆固醇检测试剂测量皮肤胆固醇含量的方法如下：

1)取10mg合成的荧光检测试剂，用二甲基亚砜(dmso)配置成10mg/ml的溶液，再用纯水稀释成0.1mg/ml的溶液，此0.1mg/ml的溶液用于猪皮以及人手掌小鱼际部位皮肤胆固醇的无创检测；

2)将检测部位的皮肤胆固醇用600ul无水乙醇萃取出来，置于气相样品瓶中；

3)用无水乙醇配置50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2ug/ml和1ug/ml的胆固醇标准品溶液。用气相色谱法分别测量标准品和萃取液中胆固醇的峰面积；

4)分析得到胆固醇标准品的峰面积与浓度的标准曲线，再计算萃取液中胆固醇的浓度，最后分析气相色谱法与荧光检测试剂的测量值的相关性来判定测量的准确性。

如图5所示，标准品的峰面积和浓度呈线性相关，无论是如图6所示猪皮还是如图7所示人手掌小鱼际部位，通过合成的荧光试剂检测到的皮肤表面胆固醇和气相色谱法测得的胆固醇含量均呈现显著地相关性，说明合成的胆固醇检测试剂可以检测到皮肤表面不同含量的胆固醇。