雄性罗氏沼虾性转变的siRNA-IR序列及其应用的制作方法

本发明涉及罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)性转变领域，具体涉及一种雄性罗氏沼虾性转变的sirna-ir序列及其应用。
背景技术：
：罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属，是一种大型淡水对虾。罗氏沼虾属热带、亚热带虾类，分布于印度洋、太平洋区域之淡水、咸淡水水域，主要分布在亚洲，特别是东南亚各国，如印度、泰国、缅甸、印度尼西亚、马来西亚等均有分布。罗氏沼虾是目前世界上最重要的淡水对虾养殖品种之一。促雄性腺(ag)是雄性甲壳动物特有的内分泌器官，它最早在蓝蟹(callinectessapidus)中发现[1]。进一步研究发现，在十足目动物发育的早期阶段切除或移植促雄性腺会导致性别逆转，提示促雄性腺在性别分化中起重要作用[2-4]。此外，越来越多的证据表明，促雄性腺在维持雄性性别分化和雄性特征方面起着关键的作用[5]。至今，甲壳动物性别分化基因最深入的研究是胰岛素样促雄激素(iag)。研究表明胰岛素样促雄激素在罗氏沼虾中起到关键作用，尤其是精子、第一和第二性特征的生成与发育[6]。与此相似，胰岛素受体(ir)和胰岛素样促雄激素有直接的相互作用。研究显示通过dsrna干扰技术对ir进行沉默后能导致精子发生的延迟，组织切片观察发现大量的精母细胞和极少量的精子[9]。至今，利用rnai技术实现性转变的都是通过dsrna方法。这方法虽然能干扰和抑制基因的表达，但其注射剂量较高，所需的序列较长，合成试剂盒较贵，成本高。对于应用到生产实践上，这方法还是存在一些成本上的因素。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种雄性罗氏沼虾性转变的sirna序列及其应用；其利用sirna干扰技术抑制ir基因的表达，促使雄性罗氏沼虾发生性转变，获得伪雌性虾(neo-female)。为实现上述目的，本发明所设计一种雄性罗氏沼虾性转变的sirna-ir序列，；所述sirna-ir正义链的核苷酸序列为gggagaacaucacccuuaagu，如seqidno.1所示；所述sirna-ir反义链的核苷酸序列为acuuaagggugauguucuccc，如seqidno.2所示。本发明还提供了一种上述的sirna-ir序列在雄性罗氏沼虾性转变为伪雌性虾中的应用。进一步地，所述应用方法的步骤如下：1)通过体外转录获得sirna-ir，2)通过第五步足基部关节膜处进行显微注射，注射的虾苗为后期幼体，完成注射疗程后进行养殖，直到出现伪雌的罗氏沼虾；其中，注射疗程为每五天注射一次，注射次数为五次，每一次sirna-ir注射浓度剂量为0.4～0.7μg/g体重。作为优选方案，所述步骤1)中，sirna-ir注射浓度剂量为0.5μg/g体重(经浓度计量的筛选。在获得最佳注射浓度剂量为0.5μg/g体重)。本发明还提供了一种含有编码上述sirna-ir序列的雄性罗氏沼虾性转变试剂盒。本发明的原理：rna干扰(rnainterference，rnai)是一种高度特异性的转录后干扰或沉默细胞基因表达的方法。显著的活性成分是小干扰rna(sirna)可以通过内源合成来抑制或干扰基因的活性。sirna可以通过体外转录产生。合成后的sirna可通过微量注射或转染进入细胞。rnai能够暂时沉默或干扰特定的基因表达，而不会对目标生物体进行基因修饰。rnai的微量注射已在实验室得到成功的证明，并被证明是最有效和最具成本效益的方法来诱导甲壳动物沉默基因表达。在甲壳动物中，利用rnai技术干扰或沉默一个基因，从而干扰该基因在胚胎或器官生长发育、细胞代谢和生殖机制中的功能[7]。通过rnai介导的沉默技术揭示了iag基因在罗氏沼虾中的功能[6]。在罗氏沼虾雄性发育早期注射dsrna-iag可引起性别转变，并获得全雄的后代[2,8]。本发明的有益效果：本发明从罗氏沼虾转录组中筛选并获得罗氏沼虾的ir基因片段。根据罗氏沼虾ir基因序列设计并合成sirna，命名为sirna-ir。在性别分化期前通过显微注射的方法导入到罗氏沼虾体内，干扰并抑制罗氏沼虾体内的ir基因的表达，促使罗氏沼虾出现性转变。sirna干扰技术与dsrna干扰技术相比较，sirna技术的注射剂量较小，能够降低成本，可以有效降低罗氏沼虾后期幼体免疫应激反应，提高伪雌虾的成活率。附图说明图1为罗氏沼虾在注射不同剂量的sirna-ir后，在精巢和促雄性腺的ir转录水平图(筛选最佳注射剂量)；图2为罗氏沼虾在注射不同剂量的sirna-ir介导ir干预后各个剂量的精巢组织的切片观察图；图3为罗氏沼虾腹表面、第二步足(爪子)和第二游泳足(腹足)在雄虾、雌虾、和伪雌虾之间的性形态特征比较图。图4为罗氏沼虾伪雌成功受精后的抱卵虾。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。实施例1能干扰并抑制ir基因的sirna筛选根据罗氏沼虾ir基因的序列(登录号：fj409645)设计并合成名为sirna-ir的干扰序列；利用在线sirna设计软件(https://www.invivogen.com/sirnawizard/design.php)设计备选sirna-ir序列(参见表1)。从备选的sirna-ir中排除含有snp位点和位于非开放阅读框架的片段，并去除gc含量过高和过低的序列，最后进行blast分析并放弃非特异性结合的序列。所获得理想的sirna-ir序列后根据takarasirna体外转录合成试剂盒的要求设计出四条oligo，命名为oligo1，oligo2，oligo3和oligo4(参见表1)。这四个oligo序列委托武汉擎科生物公司进行合成。表1sirna-ir和四个oligo的序列实施例2sirna-ir双链oligodna的制备将合成的单链oligodna用灭菌蒸馏水溶解后配制成100pmol/μl的dna溶液并按照表2和表3组份配制oligodna的退火反应液。将配制好的oligodna退火反应液置于pcr扩增仪里，95℃处理2分钟，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。这步骤能使一堆单链oligodna经退火形成双链oligodna。最终将会获得两组的oligodna并命名为oligoa和oligob。表2oligoa的退火反应液试剂剂量10xannealingbuffer2μl100pmol/μloligo12μl100pmol/μloligo22μlrnasefreedh2o14μl表3oligob的退火反应液试剂剂量10xannealingbuffer2μl100pmol/μloligo32μl100pmol/μloligo42μlrnasefreedh2o14μl实施例3sirna-ir体外转录将经过退火反应形成的oligoa和oligob按表4组份配制rna体外转录反应液，均匀混合后轻微离心以便转录反应液收集在ep管底部。将配制好的转录反应液置于pcr扩增仪里，42℃反应4小时。4小时后，将转录反应液取出，在原有的反应管中加入2μl的rnasefreednasei(5u/μl)和1μl的rnaset1(5u/μl)。轻微混匀后放入pcr扩增仪里，37℃反应2小时。体外转录结束后，将进行sirna-ir的纯化。在体外转录反应液中加入23μl的水饱和的酸性苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1)，上下倒置混合后25℃，10000rpm离心5分钟。将上层移至另一个新的ep管中，加入等量的5m的醋酸铵(ph5.6)和四倍的99.5％的无水乙醇，室温静置5分钟后，25℃，15000rpm离心10分钟。除去上清液后加入100μl的80％无水乙醇，25℃，15000rpm离心5分钟。去除上清液，干燥后加入50μl的rnasefreedh2o溶解沉淀。将以纯化的sirna-ir保存于-80℃冰箱。表4组份配制rna体外转录反应液试剂使用量10xtranscriptionbuffer2μlatpsolution2μlgtpsolution2μlctpsolution2μlutpsolution2μlrnaseinhibitor2μlt7rnapolymerase4μlrnasefreedh2o2μloligoa1μloligob1μl实施例4sirna-ir干扰剂量筛选为了筛选出sirna-ir最佳干扰剂量，设定了0.1μg/g，0.5μg/g，1.5μg/g和3.0μg/g的注射剂量。每个注射剂量分别通过显微注射方式导入体长为9.0±0.6公分的雄性罗氏沼虾。每个注射剂量的雄性罗氏沼虾为10尾。注射24小时后解剖罗氏沼虾采取精巢和促雄性腺，提取总rna，利用rt-qpcr方法对每个注射剂量进行定量检测。通过rt-qpcr方法所获得的结果显示0.1μg/g和0.5μg/g均有干扰和抑制ir基因表达的效果。但是，0.5μg/g的注射剂量起到更好的效果，这剂量能够最大化的干扰并抑制ir基因的表达。图1表明了各个注射剂量在精巢和促雄性腺中所起到抑制和干扰ir基因的表达。除此之外，通过组织切片观察，可以发现0.5μg/g能够抑制和干扰精母细胞的发育。图2表明了不同注射剂量对精母细胞发育的影响。通过这个实验，可以确定0.5μg/g是最有效的干扰剂量。实施例5sirna-ir长期干扰以0.5μg/g的剂量对后期幼体10(post-larvalstage10)进行干扰注射。通过对第五步足基部关节膜处进行将sirna-ir导入体内。注射疗程为每五天注射一次，注射次数为五次。完成五次注射后进行养殖，直到出现伪雌的罗氏沼虾。经过60天的养殖，筛选出雌虾，利用分子标记筛选出伪雌虾。最终获得2只伪雌虾。图3表明了雄虾，雌虾和伪雌虾的腹表面、第二步足(爪子)和第二游泳足(腹足)在雄虾、雌虾、和伪雌虾之间的性形态特征比较。结果发现伪雌虾的性形态特征和雌虾相似，但是伪雌虾的第二步足(爪子)比雄虾的短，比雌虾的长。图4表明了伪雌虾与雄虾交配后成功获得受精的抱卵虾。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。参考文献：1.croninle.anatomyandhistologyofthemalereproductivesystemofcallinectessapidusrathbun.journalofmorphology,1947,81(2):209-239.2.aflalo,e.d.,hoang,t.t.t.,nguyen,v.h.,lam,q.,nguyen,d.m.,trinh,q.s.,raviv,s.,sagi,a.,2006.anoveltwo-stepprocedureformassproductionofall-malepopulationsofthegiantfreshwaterprawnmacrobrachiumrosenbergii.aquaculture256,468–478.3.manorr,aflaloed,segallc.androgenicglandimplantationpromotesgrowthandinhibitsvitellogenesisincheraxquadricarinatusfemalesheldinindividualcompartments.invertebratereproductionanddevelopment,2004,45(2):151-159.4.barkia,karplusi,manorr,sagia.intersexualityandbehaviorincrayfish:thede-masculinizationeffectsofandrogenicglandablation.hormonesandbehavior,2006,50,322-331.5.venturat,aflaloed,weils,kashkushk,sagia.isolationandcharacterizationofafemale-specificdnamarkerinthegiantfreshwaterprawnmacrobrachiumrosenbergii.heredity,2011b,107(5):456–461.6.venturat,manorr,aflaloed,weils,ravivs,glazerl,sagia.temporalsilencingofanandrogenicgland-specificinsulin-likegeneaffectingphenotypicalgenderdifferencesandspermatogenesis.endocrinology,2009,150(3):1278-1286.7.katoy,kobayashik,watanabeh,iguchit.environmentalsexdeterminationinthebranchiopodcrustaceandaphniamagna:deepconservationofadoublesexgeneinthesex-determiningpathway.plosgenetics,2011,7(3):e1001345.8.venturat,manorr,aflaloed,weils,roseno,sagia.timingsexualdifferentiation:fullfunctionalsexreversalachievedthroughsilencingofasingleinsulin-likegeneintheprawn,macrobrachiumrosenbergii.biologyofreproduction,2012,86(3):86-90.9.qingguo,shihaoli,xinjialv,jianhaixiang,amirsagi,rivkamanor,fuhuali.aputativeinsulin-likeandrogenicglandhormonereceptorgenespecificallyexpressedinmalechineseshrimp.endocrinology,2018,159(5):2173-2185.序列表<110>华中农业大学<120>雄性罗氏沼虾性转变的sirna-ir序列及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>rna<213>人工合成序列(syntheticsequence)<400>1gggagaacaucacccuuaagu21<210>2<211>21<212>rna<213>人工合成序列(syntheticsequence)<400>2acuuaagggugauguucuccc21当前第1页1 2 3