核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体设计一种sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法。

背景技术：

smn2基因外显子7列入对于脊髓性肌肉萎缩症（sma）病人的重要性：研究表明sma是由于第五号染色体上运动神经元生存1（survivalofmotorneuron1,smn1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长smn蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（invertedduplication）产生了一个smn1的平行同源基因称作smn2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的smn蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由smn1中的c转变为smn2中的t（c6t），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了外显子7的列入(exon7inclusion)。smn2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作smnδ7）基本没有功能且极不稳定。smn2表达的少量全长smn蛋白虽然不足以补偿smn1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。

crispr/cas9精准靶向编辑基因改善基因功能的相关研究：随着生物技术的飞速发展，crispr/cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（science），频繁报道crispr/cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（duchennemusculardystrophy,dmd）基因治疗的论文，以dmd动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助aav载体运载基因编辑的crispr/cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的dmd基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在sma小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。

在人类体内表达smn蛋白有两个基因，smn1和smn2，但是起主要作用的smn1基因突变失去功能后，由于smn2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量smn全长基因，少量smn有功能蛋白，目前最有效的方法是aso反义寡核苷酸，精准靶向互补内含子7第10-27序列，比如16年在美国上市的寡核苷酸药物spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子iss序列，从而显著促进外显子7列入比例，但是aso半衰期较短，必须持续性给药。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法，采用crisprcase9sgrnaqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）iss序列，也可以达到使剪接沉默子iss序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进smn2外显子7列入，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法，步骤为：靶向设计sgrnaqingqinoligo序列，两端加商业化质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。

上述的核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法包括如下具体步骤：

（1）bsmbi酶切lenticrispr空载：restrietionenzyme1ul，质粒dna5ug，10×buffer5ul，补灭菌去离子水至50ul，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；

（2）将步骤（1）的酶切产物纯化备用；

（3）目标oligosgrna退火：sgrnaf（100um）2ul，sgrnar（100um）2ul，10×t4ligationbuffer2ul，t4pnk1ul，补灭菌去离子水至20ul，37℃退火30min，然后95℃退火5min，每分钟降1~6℃，梯度退至20℃火；

（4）将步骤（3）退火后的oligosgrna在1:50~1:100之间稀释；

（5）链接反应：步骤（1）的bsmbi酶切lenticrispr2~8ul，步骤（4）的oligosgrna1~3ul，10×t4ligationbuffer1~3ul，t4ligase1~3ul，补灭菌去离子水至20ul，4℃过夜链接；

（6）取步骤（5）的链接产物2~8ul，与100ul感受态细胞混匀，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴30min，加入lb液体培养基200ul，200rpm搅拌45min，取120ul涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；

（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15ml离心管，加入3~8ml（含1/1000氨苄）lb液培，37℃，200rpm过夜摇菌；

（8）质粒提取：按照axyprepplasmidminiprepkit说明书操作提取质粒，od值检测质粒浓度，然后送公司测序；

（9）对测序结构进行分析，鉴定sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒。

其中，构建的crispr重组质粒选用：

sgrnaqingqinoligo核苷酸序列(5’caccgaagattcactttcataatgc3’,3’cttctaagtgaaagtattacgcaaa5’)。

步骤（2）中利用axygenaxypreppcrcleanupkitforgenonomicdnapurification试剂盒将酶切产物纯化。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明采用crisprcase9sgrnaqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）iss序列，也可以达到使剪接沉默子iss序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进smn2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，一次性转染即可。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为本发明中进行pcr测序时的示意图；

图3为本发明中sgrnaqingqin精准靶向编辑iss序列从而显著促进smn2外显子7列入比例的示意图；

图4为在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgrnaqingqin重组质粒促进smn2外显子7列入比例的示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供一种sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒精准靶向编辑iss序列的方法，sgrnaqingqinoligo构建的crispr重组质粒能够精准靶向smn2内含子7剪接沉默子iss序列（图1a红色斜体），该沉默子附近恰好存在crispr能够识别的ngg对应序列（图1a下划线序列），而且通过基因组序列查重，设计的sgrnaqingqin序列（图1a黑色方框内）在人类基因组内是唯一的，也就是特异性序列。本发明的步骤为：靶向设计sgrnaqingqinoligo序列（图1c），两端加商业化质粒酶切位点（图1bbsmbi），构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功（图1d）。

本发明的sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒精准靶向编辑iss序列的方法包括如下具体步骤：

（1）bsmbi酶切lenticrispr空载：restrietionenzyme1ul，质粒dna5ug，10×buffer5ul，补灭菌去离子水至50ul，55℃酶切30min，然后80℃，酶切20min；

（2）利用axygenaxypreppcrcleanupkitforgenonomicdnapurification试剂盒将步骤（1）的酶切产物纯化备用；

（3）目标oligosgrna退火：sgrnaf（100um）2ul，sgrnar（100um）2ul，10×t4ligationbuffer2ul，t4pnk1ul，补灭菌去离子水至20ul，37℃退火30min，95℃退火5min，每分钟降3℃，梯度退火至20℃；

（4）将步骤（3）退火后的oligosgrna在1:50~1:100之间稀释；

（5）链接反应：步骤（1）的bsmbi酶切lenticrispr4ul，步骤（4）的oligosgrna1~3ul，10×t4ligationbuffer2ul，t4ligase2ul，补灭菌去离子水至20ul，4℃过夜链接；

（6）取步骤（5）的链接产物4ul，与100ultop10感受态混匀，冰浴10min，42℃热激90s（将质粒转入感受态细胞），冰浴30min，加入lb液体培养基200ul，200rpm搅拌45min，取120ul涂氨苄板，37℃倒置培养过夜；

（7）挑取单个菌斑与枪头一起放入15ml离心管，加入约5ml（含1/1000氨苄）lb液培，37℃，200rpm过夜摇菌；

（8）质粒提取：按照axyprepplasmidminiprepkit说明书操作提取质粒，od值检测质粒浓度，然后送公司测序；

（9）对测序结构进行分析，鉴定sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列，即鉴定目标sgrna序列是否插入载体。

下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。

转染hek293细胞，用puromycin筛选稳定株，提dna进行pcr（图2a）测序，证明sgrna2系统发挥了case9对smn2基因组有编辑的作用，箭头向后有碱基的缺失或者插入（图2b），从pam位点向下游有套峰的出现，通过ta克隆蓝白斑筛选，单克隆测序，结果表明基因编辑的部位恰好是我们设计的sgrnangg下游smn2剪接沉默子（iss）区域（图2c和图2d），以上证明本发明构建的重组质粒精准靶向编辑成功。而且通过pcr电泳，加入3ulddei酶切过夜，2%琼脂糖凝胶电泳检测，灰度值统计学分析，按照以下公式:

。

统计学分析结果显示exon7列入比例提高约10%，差异具有统计学意义（图3a和图3b），smn2基因外显子7列入比例提高了近10个百分点，而且，在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgrnaqingqin重组质粒从而显著促进smn2全长基因的表达（图4a和图4b）。

本发明sgrnaqingqin构建的crispr重组质粒可以精准靶向编辑iss序列（删除、插入及突变），可以达到使剪接沉默子iss序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进smn2外显子7的列入，该方法从基因组水平编辑，从决定蛋白表达最根本的基因组水平纠正，并且重组质粒可以整合到基因组中持续表达。

本发明关键点是设计的sgrnaqingqinoligo核苷酸序列构建的crispr重组质粒能够精准靶向编辑iss序列，从而显著促进smn2基因外显子7的例如比例。对于通过改变sgrnaqingqin序列中的某个或者少量碱基也能起到相同作用，所以碱基和该序列排序以及重复率也应视为本发明的保护范围。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。