用于C-kit基因突变检测的引物组合及其应用的制作方法

文档序号:20163293发布日期:2020-03-24 21:14阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于c-kit基因突变检测的引物组合,其特征在于,包括c-kit第9号外显子(c-kit-e9)、第11号外显子(c-kit-e11)、第13号外显子(c-kit-e13)、第17号外显子(c-kit-e17)、第18号外显子(c-kit-e18)的野生型引物和突变型引物;

其中,第9号外显子的野生型引物的正向引物序列如seqidno.1所示,

第9号外显子的野生型引物的反向引物序列如seqidno.2所示,

第9号外显子的突变型引物的正向引物序列如seqidno.3所示,

第9号外显子的突变型引物的反向引物序列如seqidno.4所示,

第11号外显子的野生型引物的正向引物序列如seqidno.5所示,

第11号外显子的野生型引物的反向引物序列如seqidno.6所示,

第11号外显子的突变型引物的正向引物序列如seqidno.7所示,

第11号外显子的突变型引物的反向引物序列如seqidno.8所示,

第13号外显子的野生型引物的正向引物序列如seqidno.9所示,

第13号外显子的野生型引物的反向引物序列如seqidno.10所示,

第13号外显子的突变型引物的正向引物序列如seqidno.11所示,

第13号外显子的突变型引物的反向引物序列如seqidno.12所示,

第17号外显子的野生型引物的正向引物序列如seqidno.13所示,

第17号外显子的野生型引物的反向引物序列如seqidno.14所示,

第17号外显子的突变型引物的正向引物序列如seqidno.15所示,

第17号外显子的突变型引物的反向引物序列如seqidno.16所示,

第18号外显子的野生型引物的正向引物序列如seqidno.17所示,

第18号外显子的野生型引物的反向引物序列如seqidno.18所示,

第18号外显子的突变型引物的正向引物序列如seqidno.19所示,

第18号外显子的突变型引物的反向引物序列如seqidno.20所示。

2.权利要求1所述用于c-kit基因突变检测的引物组合在制备检测c-kit基因突变的检测试剂或检测c-kit基因突变的检测试剂盒中的应用。

3.基于权利要求1所述用于c-kit基因突变检测的引物组合进行非诊断目的的c-kit基因突变的快速检测方法,其特征在于,包括如下步骤:

针对c-kit第9号外显子(c-kit-e9)、第11号外显子(c-kit-e11)、第13号外显子(c-kit-e13)、第17号外显子(c-kit-e17)、第18号外显子(c-kit-e18)突变位点两端分别设计一对野生型引物,并在突变位点上设计一对突变引物;

分别扩增出野生型模板和突变型片段,再用野生型引物以两个突变片段为模板进行pcr扩增,得到突变型模板,扩增对应的突变型模板;

不同比例混合野生型模板和突变型模板,用hrm方法进行区分。

4.根据权利要求3所述方法,其特征在于,pcr产物的高分辨率熔解曲线基于hrm的基因分型-tm的不同,pcr产物的tm取决于gc含量。

5.根据权利要求3所述方法,其特征在于,纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线,得到相似峰形的熔解曲线,杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线,得到不同峰形的熔解曲线;

其中,纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子。

6.根据权利要求3所述方法,其特征在于,所述不同比例混合野生型模板和突变型模板是指:使突变型模板的含量为1/10、1/100、1/1000和0,最后用hrm方法进行区分。

7.根据权利要求3所述方法,其特征在于,其包括如下步骤:

样本处理:取外周血2ml于edta抗凝管中,轻柔地颠倒混匀,4℃保存;

dna提取:取200μl抗凝血用试剂盒提取dna,采用电泳凝胶成像对dna纯度和浓度作检测;

qpcr-hrm检测,包括:对照孔的设立和检测重复孔;10μl反应体系构成;在八连管中依照次序加入各试剂,混合均匀;所有样本混合完后,将八连管置于罗氏荧光定量pcr系统仪器中进行程序性检测;

结果分析及判定:在高分辨率熔解曲线分析方法中,以阳性对照孔为分界线,样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型,差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述qpcr-hrm检测的程序包括:95℃变性10分钟;95℃变性10秒钟;退火采用探底式,设置探底退火温度为55-65℃,每个循环降低1℃,时间为10秒钟;72℃延伸30秒钟;重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟;40℃变性60秒钟;设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃,缓变率是0.05℃/s。

9.根据权利要求7所述方法,其特征在于,获取c-kit-e9、c-kit-e11、c-kit-e13、c-kit-e17、c-kit-e18突变型模板,步骤包括:

利用带有突变位点的突变引物获得突变位点前后两段突变片段;

将这两段突变片段连接起来,构成c-kit-e9、c-kit-e11、c-kit-e13、c-kit-e17、c-kit-e18突变型模板。

10.根据权利要求7所述方法,其特征在于,

获取c-kit-e9、c-kit-e11、c-kit-e13、c-kit-e17、c-kit-e18野生型模板,步骤包括:

以已知未突变基因组为模板,分别以c-kit-e9、c-kit-e11、c-kit-e13、c-kit-e17、c-kit-e18的野生型引物进行实验,获得条带单一的特异性野生型模板;将野生型模板稀释至1万-10万倍,作为检测野生型阴性对照模板用。

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