一种唾液乳杆菌LS97及其应用的制作方法

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种唾液乳杆菌ls97及其应用。
背景技术：
：表兄链球菌(streptococcussobrinus)曾称为远缘链球菌或茸毛链球菌，因其在电镜下有一层茸毛层而得名。长期以来，表兄链球菌一直被认为是一种重要的致龋齿菌，与变异链球菌相比较，表兄链球菌的产酸性能及耐酸性能更强，与高度龋齿性的关系更为密切，因此日益受到研究者的重视。目前，防治表兄链球菌引起的龋齿的方法主要包括药物法、饮食控制法及机械去除法等，如可通过使用含氟化物、酚类化合物或强氧化剂等化合物，来达到杀灭表兄链球菌的目的，但是药物的过度使用易导致细菌耐药性的增加，且伴随有相应的副作用等。而饮食控制则受到现代饮食成分复杂(含有众多的天然糖、精制糖或糖类替代品等)等问题而难以实现，因此寻找新的防治方案已成为研究的热点。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物的总称，其在肠道健康方面的应用已被广泛研究。在拮抗致病菌方面，益生菌可通过产生细菌素、过氧化氢、有机酸等多种形式达到抑制致病菌的目的。以变异链球菌为例，陈等(中国公开号cn109908185a)筛选出一株可高效抑制变异链球菌生物膜形成的植物乳杆菌ccfm8724，可使变异链球菌胞外多糖产生量减少80％左右。赵等(中国公开号cn108048347a)筛选出一株鼠李糖乳杆菌lr863，对变异链球菌的抑菌圈直径达15.35±0.06mm。但需要指出的是，目前选育可拮抗口腔龋齿菌变异链球菌的菌株报道较多，而筛选能高效抑制表兄链球菌的菌株的报道则几乎没有，相关菌株资源几乎空白。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可高效抑制表兄链球菌生长的唾液乳杆菌ls97及其应用。本发明第一方面提供一种唾液乳杆菌，命名为ls97，已于2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16922，分类命名为唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明第二方面提供一种唾液乳杆菌ls97，在制备用于缓解口腔龋齿的药物中的应用。进一步的，所述药物中包括唾液乳杆菌ls97的活菌株、干菌株或代谢物。进一步的，所述药物包括药学上可接受的载体，所述载体为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉。借由上述方案，本发明至少具有以下优点：1、唾液乳杆菌ls97可抑制表兄链球菌的生长繁殖，此外，其与浮游状表兄链球菌具有良好的共聚能力，可通过拮抗与共聚作用等清除表兄链球菌。2、对唾液乳杆菌ls97抑制其它致病菌的能力进行考察发现，ls97可高效抑制变异链球菌和血链球菌。3、利用体外实验进行菌株产酸及溶菌酶耐受性能评价，ls97可耐受高达1mg/ml的溶菌酶且产酸能力远低于表兄链球菌等。4、大鼠实验结果显示，唾液乳杆菌ls97可有效缓解龋齿的发生，效果优于洗必泰。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。附图说明图1是本发明中不同乳酸菌菌株自聚及与表兄链球菌共聚性能对比图；图2是本发明中不同乳酸菌菌株生长过程产酸性能对比图；图3是本发明中唾液乳杆菌ls97对变异链球菌和血链球菌生长抑制能力结果图；图4是本发明中大鼠龋齿得分对比图。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1唾液乳杆菌ls97的选育获得1)菌株筛选提取来自中国广西壮族自治区河池市巴马镇健康婴儿消化道提前液(采集前人群均未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无胃肠病史)的稀释液5ml，10倍系列稀释至10-6，每个稀释浓度取200μl涂布于选择性mrs培养基，37℃厌氧培养48-72h，分离获得平板上不同的单菌落。用灭菌后的接种环挑取前述不同单菌落在mrs固体培养基上划线纯化，37℃厌氧培养48h，得到纯乳酸菌菌株共11株，分别命名为a1-a11。2)分离菌株拮抗表兄链球菌的试验采用双层杯碟法考察所分离菌株a1-a11对表兄链球菌(streptococcussobrinusatcc27352，购自atcc)菌株生长的抑制作用。将1.5％(w/v)的bhi琼脂培养基倒入平皿中，凝固后将无菌的牛津杯固定在适宜的位置，然后将0.7％(w/v)的bhi培养基与表兄链球菌的混合物(107cfu/ml)倾倒在下层培养基上。待凝固后取出牛津杯，在每个孔中加入100μl乳酸杆菌的培养上清液，将上述平板在37℃(5％co2)的环境中培养过夜。实验结果如表1所示，除a1、a3、a7和a11外，其余乳酸菌均可有效抑制表兄链球菌的生长，其中乳酸菌a5抑制能力最强，其抑菌圈直径达23.1±1.1mm，高于其它菌株对表兄链球菌的抑制能力。表1不同乳酸菌对表兄链球菌的抑制能力考察注：nd表示未检测出抑菌圈3)分离菌株自聚和共聚性能分析分别取厌氧条件下过夜培养的不同菌株与表兄链球菌，3000r/min离心10min，pbs(10mmol/l，ph7.2)清洗2次，重悬，调节菌浓度至od600至0.5。共聚实验时，分别取表兄链球菌和不同菌株500μl并分别测定初始od600值ax0和ay0，混匀后37℃厌氧放置24h后测定od600值a24，共聚能力＝[(ax0+ay0)-2×a24)]/(ax0+ay0)×100；自聚实验时，分别取不同乳酸菌菌液1000μl，测定初始od600值a0，37℃厌氧放置24h后测定od600值a24。自聚能力＝(a0-a24)/a24×100。结果如图1所示，乳酸菌a5具有优异的自聚和共聚能力，其自聚和共聚能力远高于其它菌株，表明其还可通过共聚等作用清除表兄链球菌。4)分离菌株溶菌酶耐受性能分析采用双层杯碟法考察菌株对溶菌酶的耐受情况，具体操作如下：采用1.5％(w/v)的琼脂培养基制备下层培养基，待凝固后将无菌的牛津杯固定在适宜的位置，取100μlod600调节至0.5的益生菌菌液加入冷却至50℃左右含琼脂0.8％(w/v)的mrs培养基，混合均匀后倒平板。待凝固后取出牛津杯，向孔中加入50μl不同浓度的溶菌酶溶液(分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml和10.0mg/ml)，37℃厌氧培养48h测量抑菌圈直径。实验结果如表2所示，除菌株a1外，其余菌株均可在1mg/ml的溶菌酶溶液中正常生长，其中菌株a7可耐受达10mg/ml的溶菌酶浓度。正常情况下，口腔中所含溶菌酶浓度为1-57μg/ml，以上结果表明上述菌株对溶菌酶的耐受能力远远超过正常口腔内溶菌酶浓度。表2不同溶菌酶浓度对菌株的抑制性能考察5)分离菌株产酸性能分析测定不同乳酸菌菌株及表兄链球菌细菌悬液的吸光度，并用磷酸盐缓冲液调节od600值至0.5±0.02，分别按2％(v/v)的接种量分别接种到mrs或bhi培养基中，37℃(5％co2)培养24h，测定终点培养液中的ph值，结果如图2所示。致龋齿菌表兄链球菌产酸性能强，终点ph值最低。相比之下，菌株a5及a6产酸性能较弱。益生菌发酵后可产生有机酸，降低环境ph值，这虽在一定程度上可抑制一些致病菌的繁殖，但在口腔环境内，有机酸特别是乳酸的产生也容易带来更大的龋齿风险，因此从产酸性能来讲产酸性相对较弱的菌株越有利于口腔防护的应用。综合以上不同的筛选方案的结果，以对表兄链球菌抑制能力、自聚和共聚性能强，结合溶菌酶的耐受及分离菌株产酸性能分析，筛选获得菌株a5。实施例二菌株鉴定：根据实施例一获得的菌株，鉴定方法如下：对获得的菌株a5利用16srdna测序鉴定和生理生化鉴定，16srdna通用引物序列27f为：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno：1)，1492r为：5’-ggttaccttgttacgactt-3’(seqidno：2)。对菌株a5的16srdna基因序列进行扩增和测序，pcr扩增产物送上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序，菌株a5的16srdna的核苷酸序列如seqidno：3所示。经过16srdna基因对比，与genebank中的lactobacillussalivarius菌株比对相似率达100％，结合生理生化鉴定结果菌株a5鉴定为一株唾液乳杆菌，命名为唾液乳杆菌ls97，其生理生化性质如表3所示。表3菌株a5生理生化鉴定结果生化试验项目鉴定结果生化试验项目鉴定结果水杨苷-甘露糖-麦芽糖+葡萄糖酸盐-苦杏仁苷-ph3.5+半乳糖+明胶液化-阿拉伯通-厌氧生长+甘露糖-15℃生长-果糖+精氨酸产氨-注：+：阳性结果；-：阴性结果实施例三唾液乳杆菌ls97对变异链球菌和血链球菌生长的抑制能力分析同样采用双层杯碟法考察唾液乳杆菌ls97对变异链球菌(streptococcusmutansua159，购自atcc)和血链球菌(streptococcussanguinissk36，购自atcc)生长的抑制，将1.5％(w/v)的琼脂培养基倒入平皿中，凝固后将无菌的牛津杯固定在适宜的位置，然后将0.7％(w/v)的bhi培养基与含变异链球菌或血链球菌的混合物(107cfu/ml)倾倒在下层培养基上。待凝固后取出牛津杯，在每个孔中加入100μl乳酸杆菌的培养上清液。将上述平板在37℃(5％co2)的环境中培养过夜，以先前报道的一株具有抑制上述两株菌能力的唾液链球菌作为对照菌株(streptococcussalivariusk12，购自atcc)。实验结果如图3所示，唾液乳杆菌ls97可有效抑制变异链球菌和血链球菌的生长，抑菌圈直径分别达24.2±1.9和18.5±1.2mm，对上述两株致龋齿菌的抑制能力高于对照菌株唾液链球菌k12。实施例四唾液乳杆菌ls97对大鼠龋齿的缓解作用分析取3周龄左右的spf级雌性wistar大鼠饲养于温度和湿度均恒定的屏障环境中，按12h光照和12h黑夜进行饲养。所有大鼠前一星期适应环境和饮食，之后按体重随机分组，将大鼠按体重随机分为4组，每组10只，其中一组设置为空白对照组(空白组)，一组设置为龋齿模型组(龋齿组)，两组设置为干预组，干预组连续7天擦拭s.sobrinus，确定其在大鼠口腔成功定植之后，对应实验组分别连续7天擦拭洗必泰(洗必泰组)和ls97(ls97组)，之后每周3次。其中洗必泰为抑菌效果良好的离子型药物，作为阳性对照组。其中致龋细菌s.sobrinus和ls97均过夜培养12h，调节菌浓度到1×108cfu/ml后，用无菌棉签蘸取0.2ml在大鼠臼齿上擦拭，即将饱和吸收菌液的棉拭子在大鼠口腔牙齿的每四分之一部位统一作用时间为15s。实验期间，除空白对照组喂食正常饲料和饮用水外，其他组均饲以致龋饲料diet2000#和添加有5％蔗糖的饮用水，致龋饲料主要成分见表4。实验周期维持10周。表4致龋饲料diet2000#主要成分1)唾液乳杆菌ls97对大鼠体重的影响大鼠实验前后体重测定结果如表5所示。大鼠实验期间，实验组与对照组之间大鼠体重增量无显著性差异(p>0.05)，说明在动物实验期间所有的实验动物呈现出良好的身体状况。表5大鼠实验前后体重测定结果组别实验前大鼠体重(g)实验后大鼠体重(g)大鼠体重增量(g)空白组64.03±3.15205.94±21.35140.42±23.74龋齿组62.98±3.56209.32±20.12145.12±21.75洗必泰组60.32±5.28212.49±23.86147.83±19.73ls97组60.13±6.03211.51±19.75147.09±19.94注：每列各个组之间的体重均无显著差异(p>0.05)2)大鼠口腔中表兄链球菌(s.sobrinus)的变化情况在实验的第3、7、10周(分别对应实验的早、中和后期)给大鼠口腔牙齿分别进行第1次、第2次和第3次取样，在添加有12μg/ml万古霉素的mrs固体培养基上涂布进行表兄链球菌计数。龋齿模型组和干预组在感染表兄链球菌之后大鼠口腔中的表兄链球菌在2～4×105cfu/ml的范围，各组之间无显著差异，如表6中第一次取样对表兄链球菌的计数结果所示。对实验组进行干预后，两组中的表兄链球菌下降1～2个数量级，其中唾液乳杆菌ls97组中表兄链球菌数量下降更为明显，此外，洗必泰组中在第三次检验时出现表兄链球菌数量上升的情况，可能是由于菌株产生耐药性所致。以上结果显示洗必泰和唾液乳杆菌ls97均可抑制表兄链球菌数量，但唾液乳杆菌ls97干预效果优于洗必泰组。表6不同时期各组实验大鼠口腔取样表兄链球菌计数情况(log值)取样次数空白组龋齿组洗必泰组ls97组1<305.41±0.125.53±0.235.51±0.212<305.28±0.094.00±0.193.63±0.133<305.17±0.114.31±0.133.48±0.123)大鼠龋齿得分大鼠实验结束后，杀死大鼠并取出大鼠臼齿，将放置于臼齿置于0.4％的紫脲酸铵染液中过夜浸泡12h染色，清水漂洗并自然干燥后在体视显微镜下观察各组大鼠臼齿龋损情况，利用keyes龋齿计分法给大鼠牙齿进行龋齿打分。根据keyes经典评估龋齿的方法，将牙齿龋损破坏程度分为四个等级：e级龋，龋坏仅累及牙釉质；ds级龋，牙釉质龋坏及龋损累及范围不超过1/4的牙本质外层；dm级龋，龋损累及范围处于1/4～3/4的牙本质厚度；dx级龋，龋损累及范围超过3/4的牙本质厚度，结果如图4所示。从图4可知，与龋齿模型组相比，洗必泰组和ls97组均能有效减轻大鼠磨牙釉质龋(e)、牙本质浅龋(ds)和牙本质中龋(dm)的发生。另外，对比洗必泰组和ls97组作用结果可知，洗必泰组能有效减少e龋和ds龋，但对dm龋效果不明显。相比之下，ls97组对减少龋齿发生的效果要高于洗必泰，说明在治疗龋齿方面唾液乳杆菌ls97的效果胜于洗必泰。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。序列表<110>江苏微康生物科技有限公司<120>一种唾液乳杆菌ls97及其应用<130>2019<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>universalprimer<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>universalprimer<400>2ggttaccttgttacgactt19<210>3<211>1505<212>dna<213>lactobacillussalivarius<400>3tggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgaaactttctta60caccgaatgcttgcattcaccgtaagaagttgagtggcggacgggtgagtaacacgtggg120taacctgcctaaaagaaggggataacacttggaaacaggtgctaataccgtatatctcta180aggatcgcatgatccttagatgaaagatggttctgctatcgcttttagatggacccgcgg240cgtattaactagttggtggggtaacggcctaccaaggtgatgatacgtagccgaactgag300aggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta360gggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtc420ttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacacgagtgagagtaactgttcattcga480tgacggtatctaaccagcaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgta540ggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagggaacgcaggcggtcttttaagtc600tgatgtgaaagccttcggcttaaccggagtagtgcattggaaactggaagacttgagtgc660agaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacac720cagtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggttcgaaagcgtgggtagc780aaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagg840gtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcaataagcattccgcctggggagtacgaccg900caaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttta960attcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccacctaagagatt1020aggctttcccttcggggacaaagtgacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgt1080gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttgtcagttgccagcattaag1140ttgggcactctggcgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagt1200catcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgc1260aagaccgcgaggtttagctaatctcttaaagccgttctcagttcggattgtaggctgcaa1320ctcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagcatgtcgcggtgaatacg1380ttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccgg1440tggggtaaccgcaaggagccagccgtctaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgta1500acaag1505当前第1页1 2 3