一株放线菌TL-007及其应用的制作方法

本发明涉及一株放线菌tl-007及其应用。

背景技术：

近年来，用化学方法防治作物病害虽具有时间短、见效快的特点，但在防治过程中存在严重的化学农药残留问题，而且过量使用化学农药还会造成污染环境、病菌产生抗药性的问题。如人参锈腐病的防治，人参是我国名贵的中药材之一，但栽培过程中常发生各种病害影响人参产量和品质。其中，人参锈腐病是人参根部的一种土传病害，因其厚垣孢子在土壤中以休眠的方式在无寄主的条件下长期存活，造成土壤带菌，直接影响下一茬人参的种植，致使人参产生连作障碍。采用化学方法防治会使参根内积累大量有毒物质，严重影响人参品质；传统的农业防治采用施加有机肥、合理轮作、秋栽改春栽、老参地改农田等措施进行防治，但大多也只能起到预防的作用。因此，生物防治是作物病害防治的主要途径之一，急需一种具有广谱拮抗作用的生防菌。

技术实现要素：

本发明的目的是要提供了一株具有广谱拮抗作用的放线菌tl-007及其应用。

本发明一株放线菌tl-007为黑胡桃链霉菌(streptomycesnogalater)tl-007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号cgmccno.18633。

本发明的一株放线菌tl-007的应用是指在作物病害防治上的应用。

本发明采用平板稀释法分离获得了54株来源与吉林省白山市的人参根际放线菌，并对其进行了拮抗锈腐病的筛选。

放线菌的分离及纯化：取土壤样品1.0g，风干研磨分散均匀，以1：10比例溶入无菌水中，过滤取滤液作为10^-1初始液，依次获得10^-2和10^-3土壤梯度稀释液。分别在高氏1号和pda分离培养基上进行稀释涂布，28℃培养7d，直至有单个菌落长出，挑取单菌落在培养基上纯化，至最终获得单一菌株。

拮抗放线菌的筛选：采用平板对峙法，先将锈腐病菌接种在pda培养基上进行活化。在无菌操作台上，用1cm打孔器取锈腐菌菌饼放置在pda平板中央，挑取拮抗菌菌丝在距离病原菌约2cm处划一条直线，其中以不划拮抗菌菌丝的平板为对照。每组3个重复，置于28℃恒温培养箱中培养，观察菌落长势，并在第5d记录菌的最小半径以及对照菌落的半径。计算公式＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照组菌落半径×100％。tl-007对锈腐病的抑菌率为85.93％。

放线菌tl-007的its序列及系统发育分析：获得菌株16srdna基因序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比对分析，采用mega5.1构建系统进化树tl-007菌株为streptomycesnogalater属于同一分支，其相似度达到100％。通过形态特征和分子生物学鉴定结果，最终命名为黑胡桃链霉菌(streptomycesnogalater)tl-007。

本发明公开了人参根际放线菌tl-007菌株，保藏编号为cgmccno.18633。在大量的人参根际微生物中，经初筛得到几株可以拮抗人参锈腐病的菌株，再反复复筛得到拮抗效果最佳的菌株，tl-007对锈腐病的抑菌率为85.93％。经鉴定，菌株tl-007为黑胡桃链霉菌属(streptomycesnogalater)，该高效拮抗菌株能够有效抑制人参的锈腐病，无致病性。为防治人参锈腐病菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。对该菌株进行抑菌谱实验，实验表明tl-007对大豆黑斑、大豆灰霉病白菜黑腐病、人参镰刀病病菌的抑菌率，分别为：80.37％、76.37％、81.48％、82.66％，说明对大豆，白菜，人参等作物疾病有拮抗效果，具有广谱的拮抗效果。本发明菌株tl-007为高效拮抗人参锈腐病的菌株且具有广谱拮抗作用，利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性。

附图说明

图1为tl-007菌株在pda培养基上的菌落形态；

图2为tl-007菌株的显微镜图；

图3为tl-007菌株对人参锈腐病的拮抗图；

图4为tl-007菌株的抑菌谱；

图5为tl-007菌株的分子鉴定图谱；

图6为tl-007菌株在人参切片上的初步回接验证。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株放线菌tl-007为黑胡桃链霉菌(streptomycesnogalater)tl-007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号cgmccno.18633。

本实施方式采用平板稀释法分离获得了54株来源与吉林省白山市的人参根际放线菌，并对其进行了拮抗锈腐病的筛选。

放线菌的分离及纯化：取土壤样品1.0g，风干研磨分散均匀，以1：10比例溶入无菌水中，过滤取滤液作为10^-1初始液，依次获得10^-2和10^-3土壤梯度稀释液。分别在高氏1号和pda分离培养基上进行稀释涂布，28℃培养7d，直至有单个菌落长出，挑取单菌落在培养基上纯化，至最终获得单一菌株。

拮抗放线菌的筛选：采用平板对峙法，先将锈腐病菌接种在pda培养基上进行活化。在无菌操作台上，用1cm打孔器取锈腐菌菌饼放置在pda平板中央，挑取拮抗菌菌丝在距离病原菌约2cm处划一条直线，其中以不划拮抗菌菌丝的平板为对照。每组3个重复，置于28℃恒温培养箱中培养，观察菌落长势，并在第5d记录菌的最小半径以及对照菌落的半径。计算公式＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照组菌落半径×100％。tl-007对锈腐病的抑菌率为85.93％。

放线菌tl-007的its序列及系统发育分析：获得菌株16srdna基因序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比对分析，采用mega5.1构建系统进化树tl-007菌株为streptomycesnogalater属于同一分支，其相似度达到100％。通过形态特征和分子生物学鉴定结果，最终命名为黑胡桃链霉菌(streptomycesnogalater)tl-007。

本实施方式利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

具体实施方式二：本实施方式一株放线菌tl-007的应用是指在作物病害防治上的应用。

本实施方式菌株tl-007为黑胡桃链霉菌属(streptomycesnogalater)，该高效拮抗菌株能够有效抑制人参的锈腐病，无致病性。为防治人参锈腐病菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。对该菌株进行抑菌谱实验，实验表明tl-007对大豆黑斑、大豆灰霉病白菜黑腐病、人参镰刀病病菌的抑菌率，分别为：80.37％、76.37％、81.48％、82.66％，说明对大豆，白菜，人参等作物疾病有拮抗效果，具有广谱的拮抗效果。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：放线菌tl-007应用在对大豆黑斑病原菌的抑制上。其他与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：放线菌tl-007应用在对大豆灰霉病原菌的抑制上。其他与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：放线菌tl-007应用在对白菜黑腐病原菌的抑制上。其他与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：放线菌tl-007应用在对人参镰刀病原菌的抑制上。其他与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：放线菌tl-007应用在对人参锈腐病原菌的抑制上。其他与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式采用平板稀释法分离获得了54株来源与吉林省白山市的人参根际放线菌，并对其进行了拮抗锈腐病的筛选。

放线菌的分离及纯化：取土壤样品1.0g，风干研磨分散均匀，以1：10比例溶入无菌水中，过滤取滤液作为10^-1初始液，依次获得10^-2和10^-3土壤梯度稀释液。分别在高氏1号和pda分离培养基上进行稀释涂布，28℃培养7d，直至有单个菌落长出，挑取单菌落在培养基上纯化，至最终获得单一菌株(图1)和(图2)。

拮抗放线菌的筛选：采用平板对峙法，先将锈腐病菌接种在pda培养基上进行活化。在无菌操作台上，用1cm打孔器取锈腐菌菌饼放置在pda平板中央，挑取拮抗菌菌丝在距离病原菌约2cm处划一条直线，其中以不划拮抗菌菌丝的平板为对照。每组3个重复，置于28℃恒温培养箱中培养，观察菌落长势，并在第5d记录菌的最小半径以及对照菌落的半径(图3)。计算公式＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照组菌落半径×100％。tl-007对锈腐病的抑菌率为85.93％。

具体实施方式五：本实施方式广谱拮抗效果的链霉菌streptomycessp.g6的鉴定：

1.生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的培养基和方法测定tl-007菌株的生理生化特性，测定菌株能够使明胶液化、产过氧化氢酶、淀粉水解素、产吲哚乙酸、nacl的耐受度7％(表1)。

表1放线菌tl-007生理生化测试

注：放线菌tl-007生理生化测试结果：“+”为阳性；“-”为阴性

2.放线菌tl-007的its序列及系统发育分析

获得菌株16srdna基因序列，dna序列如seqidno：1所示，然后与genbank数据库中的已知序列进行blast比对分析，采用mega5.1构建系统进化树tl-007菌株为streptomycesnogalater属于同一分支，其相似度达到100％。通过形态特征和分子生物学鉴定结果，tl-007菌株为黑胡桃链霉菌株(streptomycesnogalater)(图5)。

对本实施方式的链霉菌streptomycessp.g6在对防治作物病害上的功能性验证：

试验1、平板对峙法对对大豆黑斑、大豆灰霉病、白菜黑腐病、人参镰刀病拮抗作用

采用平板对峙法，参照拮抗放线菌筛选的方法，计算tl-007对对大豆黑斑、大豆灰霉病、白菜黑腐病、人参镰刀病病菌的抑菌率(图4)，分别为：80.37％、76.37％、81.48％、82.66％。说明对大豆，白菜，人参等作物疾病有拮抗效果，具有广谱的拮抗效果。

试验2：tl-007菌株在人参切片上的初步回接验证

将获得的tl-007菌于28℃下高氏一号液体培养3d后，于10000rpm转速下离心获得菌体并加水吹打后再次离心1次，清洗菌体。将获得的菌体用无菌水配制成10⁸cfu/ml。取人参茎块放于已灭菌的培养皿中间，分4组处理，没有任何处理的ck组，在人参茎块上接种锈腐菌，接种锈腐菌后添加人参生防菌悬液，单独加有人参生防菌悬液的处理。将培养皿放入28℃的培养箱中培养5d后，观察人参茎块的腐烂情况(图6)。结果显示：加拮抗菌tl-007的处理，可以显著抑制锈腐菌的生长，而单独加拮抗菌tl-007的菌块没有腐烂，说明拮抗菌tl-007对人参茎块没有破坏的现象，拮抗菌tl-007有生防效果。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株放线菌tl-007及其应用

<160>1

<210>1

<211>990

<212>dna

<213>黑胡桃链霉菌株（streptomycesnogalater）

<400>1

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