具有增强的滋肥和杀真菌活性的生物接种剂的制作方法

【发明领域】本发明一般涉及用于提高工业作物性能的农业
技术领域：
。特别地，本发明涉及具有滋肥和杀真菌活性的生物接种剂，其增强作物植物的生长和产量。更具体地，本发明涉及具有所述组合效应的生物接种剂，其包含大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和来自木霉属(trichoderma)的特定分离株。在本发明的一个具体实施方式中，将生物接种剂施用于大豆作物以预防真菌传播的疾病。更具体地，本发明的生物接种剂可用于保护大豆作物免受镰孢属(fusariumsp.)、刺盘孢属(colletotrichumsp.)、尾孢属(cercosporasp.)、核盘菌属(sclerotiniasp.)和丝核菌属(rhizoctoniasp.)的感染。
背景技术：
：全世界每年都有数百万公顷的大豆播种。不同的播种区域跨越多种环境，其中植物可能暴露于影响作物产量的几种植物病原体。通常，作物暴露于对收获产量具有强烈影响的大量疾病中。解决这些问题的方法目前依赖于使用化学杀虫剂。然而，这些化学杀虫剂降低了环境质量并损害了农民的健康。除了农用化学品对环境的显著直接影响之外，它们的不成比例的使用是另一个需要考虑的相关方面，特别是考虑到它促进了靶向生物体中抗性的发展。这种效果的后果具有重大影响，因为侵入性试剂必须逐渐用于病原微生物，这进而导致对环境和农民的侵略性增加。因此，开发防治能够保证作物健康的植物病原体的新策略具有全球意义，特别是在不损害环境的生态完整性同时减少对人类健康的影响的情况下。目前，国家和国际农业综合企业部门已经对开发用于解决植物病害的生物来源的害虫防治产品非常感兴趣。大豆是农业产业高度发达的国家中经济最重要的作物之一。例如，在2016年期间，在阿根廷播种了超过2100万公顷，这意味着市场对使用植物病理学防治剂的需求巨大。因此，开发用于解决这种害虫问题的新一代接种剂在农业综合企业中具有很大的需求潜力。木霉属(trichoderma)包含栖息在土壤中的丝状真菌属，并且从具有工业意义的酶的生产到其用于作物疾病的生物防治的用途，对生物技术工业具有显著益处。木霉属(trichoderma)在农业领域的潜力是基于其对病原体(包括其他丝状真菌)的拮抗能力。因此，木霉属(trichoderma)株可通过3种组合作用机制发挥生物防治：霉菌寄生、抗生作用和生态位竞争(harmanetal.(2004)trichodermaspecies--opportunistic,avirulentplantsymbionts.naturereviewsmicrobiology,2,43-56.；druzhininaetal.(2011)trichoderma:thegenomicsofopportunisticsuccess.naturereviewsmicrobiology,9,749-759)。这3种机制的联合作用使木霉属(trichoderma)比化学杀真菌剂具有相当大的优势，因为它不是针对病原体中的单一作用点的化学杀真菌剂，而是在结构，生理和营养水平上显示出协同作用。在欧洲，澳大利亚和美国，使用基于木霉属(trichoderma)的生物杀虫剂已经得到推广，并且在过去的几十年中已经开发了许多产品(并且已经上市)，包括tricho-shieldtm，bio-cure-ftm，nicodermatm等等。例如，在阿根廷，rizobacter公司已经推出了名为rizodermatm(senasa登记号为38.004)的产品，其活性成分是哈茨木霉(trichodermaharzianum)分离株，已显示出对小麦和大麦作物中最重要的疾病具有有效的生物防治能力(https://www.rizobacter.com/rizoderma/)。几十年来已知木霉属(trichoderma)株的有效性及其在保护作物健康方面的应用，并且已知几种先进的遗传学研究以及大多数工业相关菌株的基因组序列。然而，还有一个问题是，用于防治害虫的生物制剂产生广谱抗微生物化合物，其将抑制对土壤质量有益的细菌的正常发育，包括大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)。哌珀霉素类、聚酮、吡喃酮、萜烯和哌嗪二酮-样化合物是木霉属(trichoderma)分离株产生的主要抗微生物化合物。已知这些化合物可抵抗细菌生长，包括那些被认为是植物有益物种的微生物(rosahermosa,rosaelenacardoza,maríabelénrubio,santiagogutiérrez,enriquemonte,secondarymetabolismandantimicrobialmetabolitesoftrichoderma,chapter10inbiotechnologyandbiologyoftrichoderma,1stedition,elsevier,2014)。此外，光照，高温和湿度会影响分生孢子的活力。目前可获得的生物杀真菌剂基于分生孢子悬浮液配制，由于分生孢子的降解使得真菌剂无效，所述分生孢子悬浮液显示出最终害虫防治产品的有限活力。特别地，本发明的生物接种剂的配方允许每毫升109个分生孢子，并且在高达106个分生孢子/ml的连续稀释中验证其害虫防治效率。所述浓度提供了优于迄今已知的生物制剂的优点，并且还允许制剂中更宽的活力窗口。尽管如此，尽管不可能预见到前面提到的抗微生物分泌化合物的影响，但本发明人已经发现了生物制剂的充分和有效组合，提供了增强的害虫防治活性并同时促进了植物生长。据发明人所知，迄今为止尚未考虑成功应用于农田的有益细菌和生物抗真菌剂的组合。特别是，没有可用的生物接种剂提供滋肥和抗真菌活性，可用于经济上有意义的农作物植物。由于本发明人的分离、培养和选择策略，本发明允许产生高效生物防治剂，达到高标准，同时防治五种最具侵袭性的大豆植物病原体。这与在106个孢子/ml浓度下在田间试验(1ml/kg种子)中达到预期结果所需的低剂量一致。本发明达到的结果超过zafari等人(zafarietal.2011.applicationoftrichodermaspeciesandbradyrhizobiumjaponicumagainstphytophthorasojaeinvivo.worldacademyofscience,engineeringandtechnology74)获得的结果(其中只有大豆疫霉(phytophthorasojae)得到防治)。此外，zafari等人的接种方案使用80ml/kg种子的剂量，并用cmc修改制剂。在本发明中开发的策略允许使用1ml/kg未经修饰的接种剂的种子，即显著更低的剂量，同时达到广泛的病原体防治。因此，本发明承认目前需要开发用于广泛耕作和有效作物生物滋肥的生物杀真菌剂，其还保护感兴趣的农作物植物免受真菌感染，同时允许成本有效，安全且易于-使用具有高商业耐久性和较长活力的配方。【发明概述】本发明描述了一种用于防治植物病原体的生物接种剂，其有助于对抗对农作物植物、更优选大豆具有很大影响的主要植物害虫，并且还有助于减少化学杀虫剂的使用。因此，本发明的第一个目的是一种生物接种剂，其包含：(a)大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)；(b)哈茨木霉(trichodermaharzianum)株，其中所述哈茨木霉(trichodermaharzianum)株包含选自seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示序列的18srrna基因序列的基因间区。在本发明的一个优选实施方式中，生物接种剂包括：(a)大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)；(b)哈茨木霉(trichodermaharzianum)株，其包含seqidno：1所示的18srrna基因序列的基因间区。在本发明更优选的实施方式中，包含seqidno：1所示的18srrna基因序列的基因间区的哈茨木霉(trichodermaharzianum)株是于2019年5月20日以保藏号pta-125914保藏于atcc的哈茨木霉(trichodermaharzianum)株。因此，本发明公开了一种于2019年5月20日以保藏号pta-125914保藏于atcc的哈茨木霉(trichodermaharzianum)株。本发明的生物接种剂发挥生物滋肥和生物防治的联合作用。该混合生物接种制剂包含大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和木霉属(trichoderma)的杀真菌剂。根据本发明的生物接种剂的一个实施方式，将大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)配制成水基提取物，并将哈茨木霉(trichodermaharzianum)株作为分生孢子悬浮液添加到大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)提取物中，分生孢子悬浮液的终浓度为106～109个孢子/ml。接种剂混合物可含有培养基残余物，包括kh2po4、k2hpo4、mgso4·7h2o、nacl、cacl2、kno3、(nh4)2hpo4、甘油、糖蜜、酵母提取物，以及生物聚合和糖苷化合物。本发明的另一个目的是还提供要求保护的生物接种剂用于保护农作物植物免受植物致病真菌感染的用途。优选地，农作物植物选自：大豆、小麦、玉米、葵花、棉花、高粱、苜蓿、亚麻、油菜、鹰嘴豆、稻、马铃薯、洋葱、玛黛茶(巴拉圭冬青(ilexparaguariensis))、茶和藤。在一个更优选的实施方式中，植物致病真菌可以选自但不限于：镰孢属(fusariumsp.)、刺盘孢属(colletotrichumsp.)、尾孢属(cercosporasp.)、核盘菌属(sclerotiniasp.)和丝核菌属(rhizoctoniasp.)。更优选地，植物致病真菌选自：土库曼镰孢(fusariumtucumaniae)、平头刺盘孢(colletotrichumtruncatum)、大豆尾孢(cercosporasojina)、油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。本发明还提供了保护农作物植物免受植物致病真菌感染的方法，所述方法包括在培养前将生物接种剂施用于农作物植物的种子。优选地，在保护农作物植物免受植物致病真菌感染的方法中，作物植物选自：大豆、小麦、玉米、葵花、棉花、高粱、苜蓿、亚麻、油菜、鹰嘴豆、稻、马铃薯、洋葱、玛黛茶(巴拉圭冬青(ilexparaguariensis))、茶和藤。在保护农作物植物免受植物致病真菌感染的方法的优选实施方式中，植物致病真菌可以选自但不限于：镰孢属(fusariumsp.)、刺盘孢属(colletotrichumsp.)、尾孢属(cercosporasp.)、核盘菌属(sclerotiniasp.)和丝核菌属(rhizoctoniasp.)。更优选地，植物致病真菌选自：土库曼镰孢(fusariumtucumaniae)、平头刺盘孢(colletotrichumtruncatum)、大豆尾孢(cercosporasojina)、油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。【附图简述】以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面，而不限制本发明的范围。图1：3种相关木霉属(trichoderma)分离株的微观和宏观表征。对于每个木霉属(trichoderma)株(a)trch3，(b)trch22和(c)trch47，显示在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基中生长的菌落的照片，其中可以看到该属的独特绿色，以及同心晕中的生长模式。插入的显微照片显示透明和分支的分生孢子梗。还可以观察到瓶状梗垂直于分生孢子梗附着。图2：通过将菌株暴露于五种农业相关病原体来进行trch3培养物中的对抗测定。在所有情况下，可以观察到木霉属(trichoderma)菌丝在病原真菌上生长，阻止病原体的生长甚至中和它，如在油菜核盘菌(s.sclerotiorum)的情况下。图3：用trch3、trch22和trch47的接种剂处理的对照植物和植物的第二三叶形叶的重量的测定。实验数据表明以至少五次重复测量的三叶形叶的平均重量。误差棒表示测量标准偏差。图4：通过抗微生物谱测定法测定木霉属(trichoderma)分离株和大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)之间的相容性，其中在各纸圆盘中使用15和70μg的氨苄青霉素将真菌上清液(3种不同浓度：1×、10×和100×)置于大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)培养物上。测量抑制晕圈以证明这种相容性。图5：根据不同生物和化学处理的谷物产量(t1：对照；t2和t3：化学杀真菌剂(分别在不同剂量d1和d2的福美双+多菌灵)；t4：本发明的生物接种剂；t5：商业产品rizodermatm；和t6：完全杀真菌剂metalaxyl+咯菌腈+thiabendazole)在农业实验站(pergamino市，布宜诺斯艾利斯，阿根廷)的田间试验中对大豆种子。柱上的不同字母表示处理之间的显著差异(fisher's最小显著差异(lsd)a＝0.10，产量lsd＝259.5kg/ha)。误差棒表示标准偏差。图6：所有样品的分级分组，显示在病原体不存在或存在下在对照和处理植物中表达的蛋白质组。在该实验中用作模型病原体系的病原体是大豆尾孢(cercosporasojina)。该研究一式三份进行。图7：病原体感染作物的差异蛋白质组学结果的统计分析(t检验，fdr＝0.05)，以火山图表示，显示两组蛋白质：一组定量增加(上调)，另一组减少(下调)。每个蛋白质组属于不同的功能簇。图8：防御相关代谢物积累的评估：处理和对照植物中的类黄酮，羟基肉桂酸衍生物(hcad)和花色素苷。不同灰色阴影的条形代表所研究的四种条件(对照、病原体、本发明的生物接种剂和本发明的生物接种剂+病原体)。每种条件的3种植物用于该测定。【发明详述】本申请公开了一种具有滋肥和杀真菌活性的生物接种剂。更具体地，所述生物接种剂具有上述组合效果，并且由肥料和杀虫剂组成，所述肥料和杀虫剂均为生物来源的。更具体地，本发明的生物接种剂包含大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和来自木霉属(trichoderma)的特定分离株。如本文上面所讨论的，本发明人寻求用于保护农作物植物免受植物致病真菌感染的生物防治剂，包括导致许多相关农作物植物中最着名的疾病的那些，例如选自大豆，小麦、玉米、葵花、棉花、高粱、苜蓿、亚麻、油菜、鹰嘴豆、稻、马铃薯、洋葱、玛黛茶(巴拉圭冬青(ilexparaguariensis))、茶和藤。更优选地，要保护免受植物病原性感染的农作物植物是大豆。特别是，对来自镰孢属(fusariumsp.)、刺盘孢属(colletotrichumsp.)、尾孢属(cercosporasp.)、核盘菌属(sclerotiniasp.)和丝核菌属(rhizoctoniasp.)的病原体的感染进行保护。更具体地说，保护作用对抗土库曼镰孢(fusariumtucumaniae)、平头刺盘孢(colletotrichumtruncatum)、大豆尾孢(cercosporasojina)、油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)的感染。本发明人进行了广泛的研究，并且能够从农业相关作物植物、特别是大豆的土壤中产生许多木霉属(trichoderma)分离株。从作物植物的根部以及土壤样品中获得总共60个木霉属(trichoderma)分离株。随后，通过形态学和集落色素沉着鉴定真菌分离株。此外，使用显微镜技术鉴定该属的独特结构。在连续几轮生长和选择后，通过它们同时防治大豆植物的五种最相关的病原体的能力进一步选择分离的菌株：土库曼镰孢(fusariumtucumaniae)、平头刺盘孢(colletotrichumtruncatum)、大豆尾孢(cercosporasojina)、油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。为了确定所选木霉属(trichoderma)分离株的属和种，基于分子生物学的方法用于鉴定内部转录间隔区(its)区域的条形码系统(druzhininaetal.,2005.anoligonucleotidebarcodeforspeciesidentificationintrichodermaandhypocrea.fungalgeneticsandbiology,fg&b.42.813-28.10.1016/j.fgb.2005.06.007)。在评估获得的基因组序列后，通过对18srrna基因(seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3)的基因间区确定的序列进行序列比对和比较，得出结论：分别称为trch3、trch22和trch47的3种鉴定的木霉属(trichoderma)分离株对应于哈茨木霉(trichodermaharzianum)株，其显示出对病原微生物的显著拮抗活性，即这些菌株具有杀真菌特性。观察分离株可以鉴定其中的气生菌丝体；此外，绿色椭圆形分生孢子是由流出和分枝的分生孢子梗产生的，具有规则配对的瓶梗。基于发明人对3种选择的分离株进行的实验测定，显示这些木霉属(trichoderma)株不抑制土壤中发现的一些有益细菌的生长。特别地，所选择的木霉属(trichoderma)株能够使慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、固氮螺菌属(azospirillum)和芽孢杆菌属(bacillus)生长，并促进具有植物致病真菌感染风险的农作物植物的令人满意的发育。根据本发明，生物接种剂包括大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和哈茨木霉(trichodermaharzianum)株，其中所述哈茨木霉(trichodermaharzianum)株包含选自seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3的18srrna基因序列的基因间区。特别地，本发明的生物接种剂的配方允许109个分生孢子/ml，并且在高达106个分生孢子/ml的连续稀释中验证其害虫防治效率。所述浓度提供了优于迄今已知的生物制剂的优点，并且还允许制剂中更宽的活力窗口。此外，本发明涉及要求保护的生物接种剂用于保护农作物植物免受植物致病真菌感染的用途，以及农业作物植物中植物致病真菌的生物防治方法，包括对目标作物的种子施用本发明的接种剂。下面，描述实验测定以更好地理解如何实施本发明。【实施例】现在将基于以下实施例进一步描述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，决不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。【实施例1：分离的木霉属(trichoderma)株的拮抗剂能力的测定】如前所述，从作物植物的根部以及土壤样品中获得总共60个木霉属(trichoderma)分离株。通过形态学、菌落色素沉着和通过显微镜技术鉴定该属的独特结构来鉴定这些样品。为了确定土壤分离株的拮抗活性，用一系列植物病原真菌进行对抗试验，包括导致植物作物中最着名的疾病的那些：镰孢属(fusariumsp.)、刺盘孢属(colletotrichumsp.)、尾孢属(cercosporasp.)、核盘菌属(sclerotiniasp.)和丝核菌属(rhizoctoniasp.)这些真菌病原菌属于许多与农艺有关的作物，如大豆、小麦、玉米、葵花、棉花、高粱、苜蓿、亚麻、油菜、鹰嘴豆、稻、马铃薯、洋葱、玛黛茶(巴拉圭冬青(ilexparaguariensis))、茶和藤。在存在上述真菌病原体的几轮生长期间，对60株木霉属(trichoderma)分离株进行攻击并选择它们同时防治上述五种病原体的能力。在60个测试的分离株中，选择了3个，其对所有测试的植物病原体呈现拮抗活性。在该体外选择方案之后，将具有增强的生物防治能力的3种分离的木霉属(trichoderma)株，在本文中称为：trch3、trch22和trch47，分别鉴定为包含选自seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示的18srrna基因序列的基因间区的哈茨木霉(trichodermaharzianum)株。通过使用马铃薯葡萄糖琼脂(pda)在固体培养基上生长菌落来进行所述3种分离的木霉属(trichoderma)株的微观和宏观表征。在不同的培养皿中观察到木霉属(trichoderma)的独特绿色着色，以及同心晕的生长模式。对应于图1中所示的本发明的3种相关木霉属(trichoderma)分离株的显微照片证实了透明和分支的分生孢子梗的存在。此外，观察到瓶状梗垂直附着于分生孢子梗。使用trch3培养物进行对抗测定，并将该菌株暴露于五种农业相关的病原体。图2显示了木霉属(trichoderma)菌落过度生长病原真菌，阻止病原体的生长甚至中和它，如在油菜核盘菌(s.sclerotiorum)的情况下。用其他两种选择的菌株trch22和trch47获得了类似的结果(未显示)。结论是这3种菌株对来自植物致病真菌感染的大豆疾病的生物防治具有高效率。【实施例2：表征分离的木霉属(trichoderma)株与大豆的相互作用】测定了3种分离的木霉属(trichoderma)株对温室条件下大豆植物生长的影响。为了实现这一目的，选择用于防治病原真菌增殖的最有效的分离菌株，并优化接种植物的分生孢子浓度(samuels&hebbar，2015)。建立生物接种剂以在低至106个孢子/ml的浓度下仍然有效。后来的测量证明，所选择的3种哈茨木霉(trichodermaharzianum)株在大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)存在下定殖于大豆植物的根部而不降低其天然结瘤能力。此外，用这些哈茨木霉(t.harzianum)株处理大豆种子甚至导致每根重量的结瘤数量增加，trch3显示出更大的效果，并且还保持每株植物的功能性结瘤的比例。下表1显示了在该实验中用选择的哈茨木霉(trichodermaharzianum)株处理的大豆植物获得的结果，在此称为trch3、trch22和trch47。表1：用菌株trch3、trch22和trch47处理的大豆植物的根发育和自然结瘤。将菌株接种在大豆幼苗中，并且当植物发育出第五三叶形叶时评估不同的参数。对照植物是未接受处理的大豆植物。根重量结瘤/gr根功能(％)对照1.4±3gr24.5±570±10trch31.9±3gr34.9±1071±5trch221.7±2gr27.4±580±10trch471.8±4gr31.8±875±8在相同的测定中，还检测到幼苗活力和发育的显著增加，表明菌株另外对接种植物的生长速率具有有益效果(基于第二植物三叶形叶的发育估计)，如图3所示。这些是关键的结果，因为它们强调技术发展的可行性并保证接种剂的有效性。【实施例3：木霉属(trichoderma)-慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)相互作用测定】建立并种植作物以评估两种微生物的生长能力：大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和木霉属(trichoderma)。与对照植物相比，还在木霉属(trichoderma)存在下评估大豆植物结瘤能力。这些试验在受控田间作物条件下进行，并允许评估真菌保护处理对种子、结瘤能力、不同生长参数和大豆最终产量的影响。处理应用于优质大豆。该实验在pergamino市实施，位于布宜诺斯艾利斯省北部(33°57'51.87"s60°34'36.89"w)，在pergamino系列土壤上，典型的argiudol，混合家庭，弗兰卡土壤质地，热，i-2级，ip＝85。播种用大豆品种dm4615sts进行，行间距为0.40米。实验地点依次记录了几种大豆作物的连续农业轮作。祖先是大豆。通过施用100kg/ha的组合物混合物(7-17-0s5)进行基础施肥。地块完全没有杂草和害虫。测试设计如下：完全随机区块，具有四个重复和五个处理。不同的处理方法详述于下表2中。表2：种子处理和大豆冠层生长-pergamino田间试验种子处理剂量t1对照t2塞仑+多菌灵d11ml/kgt3塞仑+多菌灵d33ml/kgt4大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)+trch3(本发明的生物接种剂)1ml/kgt6甲霜灵+咯菌腈+噻菌灵1ml/kg对于该测定，确定每株植物的结瘤数，结瘤大小，定位和功能性。根据该田间试验获得的结果，获得了用木霉属(trichoderma)分离株处理的植物，大量大尺寸结瘤，也是有功能的。这些结瘤主要位于次生根内。与用常规化学试剂处理的植物相比，用分离株处理的植物中结瘤的数量和质量更高。关于生理变化，用哈茨木霉(t.harzianum)或化学杀真菌剂处理的植物显示出相似的发芽率，每株植物的结瘤，荚数，光拦截，豆大小和数量。然而，在处理植物中，这些值显著高于对照植物中的值。基于这些结果，生物处理的植物表现出与化学处理的相似的性能。此外，评估了木霉属(trichoderma)分泌物对体外大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)生长的影响。使用抗生素氨苄青霉素(含有15μg或70μg)，用不同浓度(1×，10×和100×)的真菌上清液饱和的滤纸盘进行抗生素测定。将它们置于大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)菌苔上并测定抑制晕圈(图4)。表3：大豆中使用化学试剂或生物接种剂对种子进行保护处理。植物数量(播种后15天)，greenseeker的归一化植被指数(ndvi)，结瘤和荚数，辐射拦截和活力。thc：塞仑+多菌灵；本发明的生物接种剂：大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)+哈茨木霉(trichodermaharzianum)(trch3，菌株pta-125914，于2019年5月20日保藏于atcc)。met：甲霜灵；fluod：咯菌腈；thiab：噻苯达唑。【实施例4：田间大豆作物的接种效率】在该田间试验中，该实验涉及评估不同种子生物处理对大豆作物生产力的影响。该试验设计为完全随机的块，具有四个重复和六个处理(t1对照和t2-t6生物和化学处理)。不同的评估策略详述于下表4中。表4：大豆种子的化学和生物处理pergamino田间试验。种子处理剂量t1对照t2塞仑+多菌灵d11ml/kgt3塞仑+多菌灵d33ml/kgt4大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)+trch3(本发明的生物接种剂)1ml/kgt5商业产品6ml/kgt6甲霜灵+咯菌腈+噻菌灵1ml/kg商业产品：rizodermatm首先用浓度为109cfu/ml的3ml/kg大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)处理所有样品，并用每种处理进行修饰。在商业生物产品的情况下，遵循制造商的建议，使用剂量为6ml/kg的种子，以2×108cfu/ml的哈茨木霉(t.harzianum)株th2的浓度。然而，本发明的生物接种剂仅含有2×106ufc/ml的哈茨木霉(t.harzianum)trch3，并以1ml/kg种子的剂量施用。该实验在pergamino市的一个农业实验站进行，位于布宜诺斯艾利斯省北部(33°57'51.87"s60°34'36.89"w)，在pergamino系列土壤上，典型的argiudol，混合家庭，franca土壤质地，热，i-2级，ip＝85。播种用大豆品种n4619rgstsipro进行，行间距为0.40米。实验场地记录了连续的农业轮作，具有高强度水平和轮作。在处理周期中应用杀虫剂和杀真菌剂以防止棉铃虫和麦虱以及其他植物病害的侵袭。地块完全没有杂草和害虫。通过施用80kg/ha的组合物混合物(10-40-0-s9)进行基础施肥。除了专门测试的那些之外，在所有不同处理批次中的种子接种大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)。对播种后15天出现的植物进行计数。通过greenseeker传感器和辐射拦截在生长阶段r4确定ndvi。此外，通过用minoltaspad502测量叶绿素来估计氮含量，并且根据该地块的一般状态，其均匀性和健全性来鉴定植物活力。根据结瘤的数量，重量，大小和定位来评估结瘤。收获样品用于确定：产量组分，结瘤数，荚数，ng(谷粒数)和pg(谷粒重量)。通过方差分区，平均比较和回归分析评估结果。下表5描述了结瘤的变量，而表6和7显示了在作物周期中确定的产量，其组分和其他参数。表5：结瘤的定量和定性评估。在大豆中用固氮细菌，化学杀真菌剂和植物生长促进剂哈茨木霉(trichodermaharzianum)处理种子。intapergamino，田间试验。在4个重复中评估每批10株植物。商业产品：rizodermatm1结瘤数：1：无，2：稀少，3：中等，4：多，5：非常多。2结瘤尺寸：1：非常小，2：小，3：中等尺寸，4：大尺寸，5：非常大尺寸。3定位：1：完全在次生根，2：主要在次生根，3：主根:次生根平均分布，4：主要在主根，5：结瘤完全位于主根。4功能性：1：完全绿色或棕色调，2：主要为绿色或棕色调，3：色调多样，4：主要为红色调，5：所有结瘤呈红色调。表6：植物密度(植物/m2)，通过greenseeker测量的ndvi，结瘤和荚数，辐射拦截，活力，植物高度(cm)，通过spad估计的相比对照的氮含量，谷物产量，组分和响应。在大豆中用固氮细菌，化学杀真菌剂和植物生长促进剂哈茨木霉(trichodermaharzianum)对种子进行处理。pergamino，田间试验。商业产品：rizodermatm1拦截：评估为最大入射辐射的百分比。2活力指数：根据以下得分：1：最小值-5：最大值。它评估状态、植物尺寸和批次均匀性。表7：植物高度(cm)，通过spad估计的相比对照的氮含量，豆产量，组分和响应。在大豆中用固氮细菌，化学杀真菌剂和植物生长促进剂哈茨木霉(trichodermaharzianum)处理种子。pergamino，田间试验。商业产品：rizodermatm生长阶段(r3，r4或r5)遵循fehr和caviness定义建立(fehr,w.r.,caviness,c.f.,burmood,d.t.,pennington,j.s.,1971.stageofdevelopmentdescriptionsforsoybeans,glycinemax(l.)merrill.cropsci.11,929-931)。在对大豆种子进行生物处理后测定豆产量评估。pergamino中的田间试验获得的结果如图5所示。尽管在该实施例中描述的田间试验期间降雨量很少，但是能够维持产量组分。初始储备和周期结束时的降雨都会对水分胁迫产生适度影响。产量达到平均值4234.6kg/ha(表7和图5)，对于当年的环境条件而言可接受。产量之间的差异具有统计学意义(p＝0.08；cv＝6.9％)。一组3种处理，即：大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)+trch3(本发明的生物接种剂，t4)，商业产品(t5)和完全杀真菌剂甲霜灵+咯菌腈+噻苯达唑(t6)达到最大产量，超过对照(t1)，并且在用本发明的生物接种剂(大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)+trch3)处理的情况下也超过化学杀真菌剂(t2和t3)。结瘤具有中等至优质。显然，降雨量不足限制了植物的结瘤。用哈茨木霉(trichodermaharzianum)(t4和t5)接种的处理比其对照具有更好的结瘤(表5)。尺寸和(在较小程度上)结瘤定位，是最具代表性的变量(表5)。可以清楚地看出，除了其作为病原体防治剂的功能之外，木霉属(trichoderma)的使用还能够刺激生长并增强一些主要的产量组分。更准确地说，通过确定系数(r2)测量，更好地解释获得的产量的那些变量是ng(r2＝0.97)，pg(r2＝0.70)，结瘤大小(r2＝0.62)，定性活力(r2＝0.45)和每个荚的结瘤(结瘤/荚)数量(r2＝0.36)(表5、6和7)。根据在该实施例中描述的田间试验中获得的结果，用于大豆的生物处理导致几种作物参数的重要增强，显示本发明的接种剂中包含的微生物，哈茨木霉(trichodermaharzianum)和大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)的高度相容性。与传统的磷-硫(ps)施肥相比，这种新的施肥策略使作物产量增加了482.3kg/ha。应该注意的是，与参考生物杀虫剂(商业产品rizodermatm)相比，本发明的生物接种剂产生了更好的结果，即使在6倍低剂量浓度下也是如此，因此显示出制剂的增强效果。【实施例5：本发明生物接种剂的作用方式的分子分析】通过使用无标记定量分析技术，通过差异蛋白质组学进行本发明的生物接种剂的作用模式的分子分析，以分子鉴定哪些是导致作为用本发明的生物接种剂处理的结果植物防御系统的预活化状态的机制。另一方面，测量所述防御代谢物的积累。差异蛋白质组学研究允许分析在两种不同情况下受影响的蛋白质组，相比感染了大豆尾孢(cercosporasojina)(负责在大豆作物中产生“蛙眼斑病”的病原体)的大豆植物：在一种情况中，用本发明的生物接种剂在接种病原体之前进行初始处理，而在另一种情况下，用病原体直接接种而不用本发明的生物接种剂处理。如表8中所述进一步进行两种对照。表8：处理对照病原体本发明的生物接种剂本发明的生物接种剂+病原体本发明的生物接种剂--++大豆尾孢(cercosporasojina)-+-+对于该研究，在每次处理中使用在用本发明的接种剂播种时接种的12株大豆植物。萌发后9天，植物感染了大豆尾孢(cercosporasojina)(这是导致眼蛙病的叶病原体)。感染后三天收集叶样品用于蛋白质分析。用于该研究的条件总结在上表8中。将研究中的每组的每株植物的两片叶子在液氮中冷冻并用研钵和研杵研磨。进一步处理0.5g叶粉样品用于其研究。以下描述了不同测定所遵循的方案：【蛋白质提取】用1ml提取缓冲液[be：在tris-hcl(100mm，ph＝8.0)中chaps(4％p/v)，edta(10mm)，蛋白酶抑制剂(sigmafast，sigmaaldrich)]处理0.5g叶而获得生物提取物。然后，通过在4℃以15000rpm离心30分钟来除去不溶性植物材料。保存200μl上清液等分试样以在-20℃冷冻。【丙酮蛋白沉淀】用1ml冷丙酮(-20℃)沉淀每种提取物的200μl等分试样中的蛋白质含量。将它们在-20℃温育2小时，在4℃和15000rpm离心30分钟。将得到的沉淀用1ml冷丙酮(-20℃)洗涤两次。将沉淀的蛋白质溶解在200μl的be中，通过在4℃下以15000rpm离心30分钟来除去不溶物质。蛋白质提取物在-20℃保存。【液相色谱与质谱联用分析】将一式三份分析的每个样品进行胰蛋白酶酶消化。然后，将2μg所述消化物进行串联偶联的质谱分析的液体纳米色谱。使用thermoscientific的easy-nlc1000系统和q-exactivethermoscientific质谱仪使用ac18，2μm，100a，50μm×150mm[thermoscientific，easy-spraycolumnpepmaprslc(p/nes801)]柱。对结果的第一次分析证明了本发明的生物接种剂在分子水平上对大豆植物的差异作用。树状图显示在图6中，其清楚地显示了对照和病原体处理之间的差异蛋白质谱(表8)。尽管如此，当比较未感染和感染的植物时，这种差异并不明显，而后者先前已经用本发明的生物接种剂处理过。这些结果表明，用本发明的生物接种剂接种可稳定作物代谢以抵抗c.sojina攻击。显示在测试植物中表达的蛋白质组的所有样品的分级分组揭示了先前用本发明的生物接种剂处理的植物与未接种的植物之间的相似性。基于蛋白质组学分析，用本发明的生物接种剂处理的感染和未感染的植物在分层树中显示出密切的关系，表明由于本发明的生物接种剂的保护作用，病原体的作用的严重性降低。当对来自感染病原体的作物的蛋白质组学结果进行统计分析时(分别使用和不使用本发明的生物接种剂处理)，可以区分两组蛋白质，一组蛋白质组分定量增加(上调)而另一组蛋白质组分减少(下调)。将这两种蛋白质组中的每一种分组成功能簇。图7显示了说明这两组蛋白质的火山图。基于该分析，本发明人能够以精确的方式建立在种子先前用本发明的生物接种剂处理时植物防御过程的预活化中涉及的途径和细胞机制中的差异模式的存在。【实施例6：评估大豆植物中防御代谢物的积累】通过首先用3ml酸性甲醇(1％hcl)处理上述实施例5的表8中所示的每种处理的0.5g叶粉，然后在室温下孵育8小时和以3,000×g离心2分钟，得到甲醇提取物。随后，通过光谱测定法测量上清液中存在的防御代谢物，测量320nm，360nm和517nm处的吸光度，分别测定类黄酮，羟基肉桂酸(hcad)衍生物和花色素苷。因此，相对于对照确定其相对值(图8)。在评估防御代谢物的积累时，获得的结果与蛋白质组学分析观察到的结果相关。正如预期的那样，在病原体感染后，防御代谢物的合成被活化；然而，先前用本发明的生物接种剂接种使得具有增强的防御反应的植物具有更高水平的抗微生物代谢物。【序列】序列表<110>y-tec<120>具有增强的滋肥和杀真菌活性的生物接种剂<130>00-fungbiol<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>555<212>dna<213>哈茨木霉（trichodermaharzianum）<400>1tgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagcccc60ggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtt120tttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaact180ttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagta240atgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagt300attctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcg360gcgttggggatcggccctgccttggcggtggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgc420cgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagc480cgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaact540taagcatatcaaaaa555<210>2<211>555<212>dna<213>哈茨木霉（trichodermaharzianum）<400>2tgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagcccc60ggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtt120tttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaact180ttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagta240atgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagt300attctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcg360gcgttggggatcggccctgccttggcggtggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgc420cgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagc480cgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaact540taagcataagaaaaa555<210>3<211>555<212>dna<213>哈茨木霉（trichodermaharzianum）<400>3tgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagcccc60ggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtt120tttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaact180ttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagta240atgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagt300attctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcg360gcgttggggatcggccctgccttggcggtggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgc420cgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagc480cgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaact540taagcatataaataa555当前第1页1 2 3