本发明属于微生物应用技术领域，具体是一种利用淀粉生产聚苹果酸的出芽短梗霉及其应用。
背景技术：
聚苹果酸[poly(β-l-malicacid)，pma]是以l-苹果酸为唯一单体通过α-羟基和β-羧基脱水聚酯而成的一种新型高分子化合物，具有良好的水溶性、生物降解性、生物相容性和化学修饰性，在医药、食品、农业和环境治理等方面有着广阔的应用前景。聚苹果酸的生产方法有化学合成法和生物合成法。化学法合成聚苹果酸步骤复杂、副产物较多、产物分子量较小且成本较高；而生物法合成聚苹果酸操作简单、副产物较少、产物分子量较大且成本较低，因此采用生物法合成聚苹果酸是目前的研究热点。多头绒泡菌（physarumpolycephalum）和出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）都被证实可以用于发酵生产聚苹果酸。其中多头绒泡菌发酵生产聚苹果酸产量在3.3g/l左右，分子量可达到50～300kda；而出芽短梗霉合成聚苹果酸能力较强，单批发酵产量在12～60g/l，分子量为4～11kda。相比于分子量较高的聚苹果酸，低分子量聚苹果酸具有更好的水溶性、生物降解性和生物相容性。因此，无论是在聚苹果酸产量还是分子量方面，利用出芽短梗霉合成聚苹果酸都更具有开发应用价值。
出芽短梗霉分类属于半知菌纲，是一种具有酵母型和菌丝型的多形态真菌，在世界各地广泛分布。通常大多数出芽短梗霉菌会产生黑色素，俗称黑酵母真菌。出芽短梗霉能代谢产生聚苹果酸、普鲁兰糖、酶制剂、黑色素、短梗霉素等多种产物。菌种是发酵工业的核心，因此国内外研究人员在生产聚苹果酸的出芽短梗霉菌株选育方面做了大量工作。例如，专利cn102220248从植物叶片表面筛选获得一株出芽短梗霉zd-3d，以葡萄糖（12%，w/v）为碳源，在添加发酵促进剂富马酸钠的条件下，25℃摇瓶分批发酵168h，聚苹果酸产量为62.27g/l；专利cn102827778通过自然选育获得一株出芽短梗霉fmt1801，以糖蜜（12%，w/v）为碳源，25℃发酵罐分批发酵96h，聚苹果酸产量为34.4g/l；专利cn101979499通过紫外线诱变技术选育获得一株出芽短梗霉tkpm00006，以葡萄糖（12%，w/v）为碳源，25℃摇瓶分批发酵7～12天，聚苹果酸产量为18.4±1.3g/l。
可见，目前众多研究人员通过自然选育或诱变选育获得了多株能合成聚苹果酸的出芽短梗霉，但是通过比较发现，这些菌株在发酵生产聚苹果酸过程中仍存在一些不足：（一）高浓度葡萄糖作为碳源，一方面原料成本较高，另一方面高浓度葡萄糖对菌体生长存在底物抑制作用进而限制聚苹果酸产量的提高；而以糖蜜作为碳源时，由于糖蜜本身颜色较深、杂质含量较多，尽管原料成本有所下降，但会增加聚苹果酸提取纯化和发酵废液处理的费用。（二）尽管聚苹果酸产量较高的可达62.27g/l，但培养基中需要添加富马酸钠作为发酵促进剂，增加了发酵原料成本。（三）上述三种出芽短梗霉的发酵培养基中均需要添加一定量的玉米浆或玉米浸出液，一方面增加了发酵原料成本，另一方面由于玉米浆或玉米浸出液成分复杂、质量难以控制，对发酵过程的影响存在不确定性。（四）上述三种出芽短梗霉的发酵温度均为25℃，而微生物发酵是一个放热过程，因此较低的发酵温度需要提供大量的冷却水来维持，从而提高发酵设备运行成本。
为了解决上述出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸存在的问题，本申请人已在前期的研究中筛选分离得到了一种可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵高产聚苹果酸的出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)gxz-6，并提交了专利申请，申请日：2017年11月20日，申请号：201711159740.x，发明名称：一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途。虽然出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)gxz-6可以利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，且可在30℃条件下分批发酵获得60g/l以上的聚苹果酸，但是其在发酵过程中产生黑色素，发酵过程产生的黑色素通常会造成代谢产物下游分离提取困难，影响聚苹果酸产物得率和产品外观。
技术实现要素：
为了解决上述出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸存在的问题，本发明的目的是提供一种利用生淀粉或淀粉液化液高效生产聚苹果酸的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1，及其在生产聚苹果酸中的应用。出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1在不添加发酵促进剂和生长因子的条件下，分批发酵最高可得到57g/l聚苹果酸，且发酵过程中不产生黑色素，具有发酵成本低、产物易纯化、工艺简单的优点，极具工业生产潜力。
一种利用淀粉生产聚苹果酸的出芽短梗霉，分类命名为出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1，保藏编号为cctccno：m2018519，保藏日期为2018年08月01日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1具有下述特性：
1、菌落形态特征：
在pda培养基平板上30℃培养，菌落表面最初为白色粘稠状，逐渐变为淡粉色，边缘出现伸入琼脂内部的菌丝，最终整个菌落变成粉色。所述pda培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加蒸馏水定容至1l制得。
2、生理生化特性：
菌株gxl-1可在25～34℃下较快生长，最适培养温度为30℃；培养基中不需要添加生长因子；可在察氏、萨氏、酵母蔗糖、淀粉、油脂、柠檬酸盐、酪蛋白等基础或半合成培养基中生长，但是不能在明胶和葡萄糖醋酸盐培养基中生长。
3、its序列分析：
利用真菌its通用扩增引物its1（5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和its4（5’-tcctccgcttattgatatgc-3’）对its序列进行扩增测序，测得序列长度540bp。将所得序列提交至genbank数据库，获得序列编号genbankid:mk041290，与genbank所提供的基因序列进行blast比对分析，结果表明菌株gxl-1与出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）同源性为100%。结合菌落形态特征、生理生化特性和its序列分析，可以将菌株gxl-1分类鉴定为出芽短梗霉，具体为出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1。
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1的its核苷酸序列为dna序列表所示的核苷酸序列。
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用淀粉生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，28～30℃恒温培养2～3天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有80～100ml液体种子培养基500ml摇瓶中。在摇床转速160～220rpm，温度25～30ºc条件下培养36～48h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖80～100g/l，氯化铵1-2g/l，kcl0.4～0.6g/l，kh2po40.05～0.2g/l，mgso4·7h2o0.1～0.3g/l，znso4·7h2o0.05～0.2g/l，caco310～30g/l。
（3）发酵培养：将培养得到的种子液按照8～10%（v/v）接种量接入装有30～40ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速160～220rpm，温度25～30℃条件下培养8～9天得到发酵液。所述液体发酵培养基为碳源120～160g/l，氯化铵1～3g/l，kcl0.4～0.6g/l，kh2po40.05～0.2g/l，mgso4·7h2o0.2～0.6g/l，znso4·7h2o0.05～0.2g/l，caco330～50g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
所述液体发酵培养基的碳源为木薯淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、淀粉液化液中的任意一种或两种以上组合。
所述淀粉液化液是利用木薯淀粉、小麦淀粉或玉米淀粉糊化后经过α-淀粉酶液化制得。具体工艺条件为淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶（≥3700活力单位/克），于60℃搅拌酶解60min，即得淀粉液化液。
本发明的有益效果是：
本发明的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1可以利用生淀粉或淀粉液化液发酵生产聚苹果酸，相较于利用葡萄糖发酵生产聚苹果酸而言，原料成本更低，且不存在高浓度葡萄糖对菌体生长产生抑制作用的问题；相较于利用糖蜜发酵生产聚苹果酸，原料杂质少，有利于降低聚苹果酸提取纯化和发酵废液处理的费用。此外，出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1发酵生产聚苹果酸的过程中不需要添加代谢促进剂（如富马酸钠）或生长因子（如玉米浆），菌株营养要求简单、发酵成本低廉，可满足工业化大规模生产，具备显著的经济效益。
本发明的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1可在较高温度30℃条件下发酵生产聚苹果酸，最高产量可达到57g/l。相较于大多数出芽短梗霉25℃发酵生产聚苹果酸而言，聚苹果酸产量更高，且能够大大减少发酵过程中冷却水的消耗，具有更好的工业生产价值。
在专利申请201711159740.x的发酵方法中，虽然在发酵培养基中增加硝酸钠，可以实现在生产成本没有较大的提高的情况下，使聚苹果酸产量大大提高。但是硝酸钠对皮肤、粘膜有刺激性，有毒，而且具有强氧化性，与有机物或磷、硫接触、摩擦或撞击能引起燃烧和爆炸。本发明在液体种子培养基和液体发酵培养基中使用氯化铵替代硝酸钠作为氮源，虽然产量稍有降低，但是氯化铵更为安全，且成本更低。出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1可以直接利用糊化后经过α-淀粉酶液化制得的淀粉液化液为碳源发酵得到高产量的聚苹果酸，无需再经过β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化淀粉液化液步骤，进一步降低了生产成本，且发酵过程中不产生黑色素，产物易纯化，得到的产物外观好、得率高。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用木薯淀粉生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，30℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有80ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖100g/l，氯化铵2g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（3）发酵培养：将培养得到的种子液按照8%（v/v）接种量接入装有30ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养9天得到发酵液。所述液体发酵培养基为木薯淀粉120g/l，氯化铵1g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.6g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco340g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
实施例2
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用小麦淀粉生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，30℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有80ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖100g/l，氯化铵2g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（3）发酵培养：将培养得到的种子液按照8%（v/v）接种量接入装有30ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养9天得到发酵液。所述液体发酵培养基为小麦淀粉120g/l，氯化铵1g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.6g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco340g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
实施例3
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用玉米淀粉生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，30℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有80ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖100g/l，氯化铵2g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（3）发酵培养：将培养得到的种子液按照8%（v/v）接种量接入装有30ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速220rpm，温度25ºc条件下培养9天得到发酵液。所述液体发酵培养基为玉米淀粉120g/l，氯化铵1g/l，kcl0.6g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.6g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco340g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
实施例4
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用木薯淀粉液化液生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，28℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有100ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速180rpm，温度30ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖80g/l，氯化铵1g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.05g/l，caco320g/l。
（3）将培养得到的种子液按照10%（v/v）接种量接入装有40ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速180rpm，温度30℃条件下培养8天得到发酵液。所述液体发酵培养基为淀粉液化液160g/l，氯化铵3g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
所述木薯淀粉液化液是利用木薯淀粉糊化后经过α-淀粉酶液化制得。具体工艺条件为木薯淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与木薯淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶（≥3700活力单位/克），于60℃搅拌酶解60min，即得木薯淀粉液化液。
实施例5
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用小麦淀粉液化液生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，28℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有100ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速180rpm，温度30ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖80g/l，氯化铵1g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.05g/l，caco320g/l。
（3）将培养得到的种子液按照10%（v/v）接种量接入装有40ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速180rpm，温度30℃条件下培养8天得到发酵液。所述液体发酵培养基为淀粉液化液160g/l，氯化铵3g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
所述小麦淀粉液化液是利用小麦淀粉糊化后经过α-淀粉酶液化制得。具体工艺条件为小麦淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与小麦淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶（≥3700活力单位/克），于60℃搅拌酶解60min，即得小麦淀粉液化液。
实施例6
出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1利用玉米淀粉液化液生产聚苹果酸，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉（aureobasidiumpullulans）gxl-1划线于pda斜面培养基上，28℃恒温培养2天。
（2）种子培养：在活化好的菌种斜面上刮取一环，接种到装有100ml液体种子培养基500ml摇瓶中，在摇床转速180rpm，温度30ºc条件下培养36h得到种子液。所述液体种子培养基为葡萄糖80g/l，氯化铵1g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.05g/l，caco320g/l。
（3）将培养得到的种子液按照10%（v/v）接种量接入装有40ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在摇床转速180rpm，温度30℃条件下培养8天得到发酵液。所述液体发酵培养基为淀粉液化液160g/l，氯化铵3g/l，kcl0.5g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.2g/l，caco330g/l。
（4）聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80%乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
所述玉米淀粉液化液是利用玉米淀粉糊化后经过α-淀粉酶液化制得。具体工艺条件为玉米淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与玉米淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶（≥3700活力单位/克），于60℃搅拌酶解60min，即得玉米淀粉液化液。
分别对实施例1-6生产得到的聚苹果酸进行产量检测，检测方法如下：取发酵上清液加入等体积的2m硫酸，90℃恒温水解过夜。再取水解后溶液中的苹果酸经高效液相色谱分析；色谱柱采用c18色谱柱，流动相为50mmkh2po4溶液，流速为0.7ml/min，进样量为5μl，温度为25℃。检测结果如下：
序列表
<110>广西大学
<120>一种利用淀粉生产聚苹果酸的出芽短梗霉及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>540
<212>dna
<213>出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)
<400>1
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