芳香镰孢属真菌HNU066及其在含硫化氢废气降解中的应用的制作方法

本发明属于环境污染治理领域，涉及一株芳香镰孢属(fusariumredolens)硫化真菌hnu066及其在含硫化氢工业废气生物降解中的应用。

背景技术：

随着环境污染的加剧，工业废气排放成为影响人们健康生活的一大罪魁祸首。在实际工业废气排放中，含硫化氢的废气占有重要的比例，因此被列入国家优先控制的气体污染物之一。硫化氢是一种具有臭鸡蛋味的恶臭性气体，严重影响周边居民生活，因此，大量含硫化氢废气的排放严重损害人类健康。此外，排放进入大气的硫化氢氧化后形成硫酸根离子，是形成酸雨的主要原因。研发高效、无二次污染的生物降解技术是解决这类含硫化氢废气污染的有效技术之一。

近年来，人们筛选得到大量清除硫化氢能力的微生物，该类微生物可将硫化氢转化为硫酸盐，从而固定硫化氢，减少硫化氢对大气的污染。通过真菌来去除硫化氢也是生产实践中的常用方法。人们发现，一种担子菌类真菌可以快速的降解硫化氢，使之氧化为so4和so3。一种含真菌的生物反应器也被应用于养猪场硫化氢的清除。

利用生物滴滤塔处理工业废气为当下热门的一种生物技术。生物滴滤塔反应器内安装固体填料床，培养微生物，并使微生物在固体填料表面附着生长形成牢固的生物膜，废气流经生物反应器，有害物质吸附到生物膜上进而被微生物所降解。在启动生物滴滤塔反应器清除废气的启动阶段，需要往底泥中接种特别的微生物。但是目前的生物滴滤反应器存在效率低、有效时间短、保存困难和维护成本高等缺点，这在一定程度上限制了生物滴滤反应器在废气净化领域的应用。从生物滴滤塔底泥中筛选具有吸收、降解硫化氢的高效真菌，并将其以人工方式培养后再加入生物滴滤塔反应器中，可以达到改良生物滴滤反应器的效果。此外，筛选得到的高效真菌，为研究含硫化氢废气的生物降解机制提供了实验材料。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种芳香镰孢属(fusariumredolens)真菌菌株“hnu066”。

本发明提供的芳香镰孢属(fusariumredolens)真菌菌株“hnu066”，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctccno:m2019500，保藏日期：2019年6月27日。

该菌株的生物学特征如下：在pda培养基，温度25℃下，菌丝发达，质地呈绒毛状；幼时颜色为浅白色，老后颜色为浅黄色；光学显微镜下观察未见孢子及产孢结构。

本发明所涉及菌种的筛选技术方案是：

所提供菌株于化工企业的生物滴滤塔反应器活性污泥驯化池中筛选获得。采取生物反应器驯化后的污泥5g，以蒸馏水稀释至10倍、100倍和1000倍三个不同的浓度梯度，分别涂布于pda真菌固体培养基上。所述的pda真菌培养基为：葡萄糖0.5g，k2hpo40.5g，kh2po41.5g，(nh4)2so40.5g，nacl0.5g，mgso40.2g，cacl20.05g，feso40.02g，琼脂糖15.0g，补水至1000ml，ph值调整至6.5-7.2。每个培养皿加入一毫升稀释后的污泥提取物，在25℃下恒温避光黑暗培养，培养一周后观察形成的独立菌落。从选定的单菌落挑选新鲜的菌丝体，移到新鲜的真菌培养平板，划线分离培养，重复上述操作直至获得纯培养物，转入真菌培养基斜面保存。

采取真菌dna提取试剂盒，提取芳香镰孢属真菌hnu066的基因组总dna，并利用真菌its区的通用引物扩增所选真菌的its区间序列，扩增的结果序列如seqidno.1所示。通过在ncbi中进行的blast检索，结果表明其与芳香镰孢属真菌mlt5(genebank登入号：mh299949.1)的同源性最高，为99.46％，故鉴定该菌株为芳香镰孢属(fusariumredolens)真菌。

本发明的另一个目的是提供上述芳香镰孢属真菌hnu066在含硫化氢废气降解中的应用。

作为优选，芳香镰孢属真菌hnu066在生物滴滤塔反应器降解净化含硫化氢废气中的应用

所述的芳香镰孢属真菌hnu066悬液吸附于基质上，并压制成型作为生物滴滤塔的真菌加强型填料；其中每克基质中含有不低于2.5×10⁷cfu的真菌hnu066，基质为活性炭、麦麸和木屑按照1：1～1.2：2～2.5的质量比混合的混合物。

本发明的又一个目的是提供一种发酵制品，为芳香镰孢属真菌hnu066的发酵液或液体菌剂。

发酵液的制备方法具体如下：芳香镰孢属“hnu066”真菌经pda固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量(即种子液和发酵培养基的体积比为1:10)进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；

发酵培养的条件为：28-33℃，保持溶解氧高于1.5mg/l，发酵罐压强为0.05mpa，每一轮培养时间72h；

发酵培养基包括葡萄糖0.5g，k2hpo40.5g，kh2po41.5g，(nh4)2so40.5g，nacl0.5g，mgso40.2g，cacl20.05g，feso40.02g，补水至1000ml，ph值调整至6.5-7.2；

液体菌剂的制备方法具体如下：芳香镰孢属“hnu066”真菌经pda固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量(即种子液和发酵培养基的体积比为1:10)进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；将发酵液置于4℃冷冻离心机，3000×g转速下，离心20min，弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8g/l的真菌悬液。

发酵培养的条件为：28-33℃，保持溶解氧高于1.5mg/l，发酵罐压强为0.05mpa，每一轮培养时间72h；

发酵培养基包括葡萄糖0.5g，k2hpo40.5g，kh2po41.5g，(nh4)2so40.5g，nacl0.5g，mgso40.2g，cacl20.05g，feso40.02g，补水至1000ml，ph值调整至6.5-7.2；

本发明具有的有益效果是：

1)利用筛选得到的具有硝化能力的芳香镰孢属真菌“hnu066”，人工增加其在生物滴滤塔反应器活性填料中的丰度，可提高生物活性填料对含硫化氢废气的清除效率。添加芳香镰孢属真菌“hnu066”的反应器，在进入稳定期后，针对含硫化氢废气的吸收清除效率相比对照组提高34.5％；

2)添加芳香镰孢属真菌“hnu066”后的活性填料，其驯化时间缩短2天，可快速启动生物滴滤塔反应器；

3)芳香镰孢属真菌“hnu066”菌种可长期保存，-80度超低温冰箱中保存一年后，经活化可继续使用，对含氨废气的清除效率没有显著下降，具有较好的可保存性。

附图说明

图1为生物反应器结构示意图；

图2为菌株的菌落形态图；

图3为菌株的微观结构图；

图4为系统发育树图。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本专利进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本专利。

实施例1：芳香镰孢属真菌“hnu066”的筛选、分离、及培养

芳香镰孢属真菌“hnu066”是分离自罗赛洛(温州)明胶有限公司生物反应器(图1)。其分离方法如下：取驯化后的生物滴滤塔反应器污泥5g，以蒸馏水稀释至10倍、100倍和1000倍三个不同的浓度梯度，分别涂布于pda真菌固体培养基上。每个培养皿涂布一毫升稀释后的污泥浸出液，在25度下恒温黑暗培养，培养一周后观察形成的单菌落。从选定的单菌落边缘挑取菌丝体，转移到新鲜的pda平板划线分离培养，重复划线操作，直至获得纯培养物，转入pda斜面保存。

实施例2：芳香镰孢属真菌“hnu066”的形态学及分子生物学鉴定

在显微镜下，观察内生真菌的菌落、菌丝和孢子等特征，参照《真菌鉴定手册》进行鉴定。具体而言，采用点种法将筛选到的芳香镰孢属真菌“hnu066”菌株点种于pda平板上，置于25度恒温培养，肉眼观察菌株的形态特征，包括菌落形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝性状、生长速度等特征。挑取菌落表面菌丝，置于光学显微镜(日本，olympus)观察有无孢子和产孢结构等。

本发明的芳香镰孢属真菌“hnu066”的形态特征如下：

如图2和图3所示，芳香镰孢属真菌“hnu066”菌株在pda培养基，温度25度下，菌丝发达，质地呈绒毛状；幼时颜色为浅白色，老后颜色为浅黄色；在pda平板上未见孢子及产孢结构。

实施例3：芳香镰孢属真菌“hnu066”的分子生物学鉴定

采取通用真菌dna提取方法，提取芳香镰孢属真菌“hnu066”的基因组dna。提取方法如下：取1.5ml菌液，12000×g，2min，收集菌体；加入500μl5×ctab(包含1％β-巯基乙醇)，液氮中速冻30s，再转至65度下温浴30s，反复上述过程3次；高速涡旋震荡3-5min，65度温浴20min，加入2ml酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，v/v/v)，12000×g，10min，取上清液；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇，静止20min后再次离心；倒掉上清液，以70％的酒精洗涤沉淀物；自然条件下干燥，得到真菌dna备用。

用真菌通用引物its5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg–3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)，经pcr技术，扩增出真菌基因组的rrna基因内部转录间隔区(its)。将pcr产物纯化后测序。通过在ncbi中进行的blast检索，结果表明其与芳香镰孢属真菌mlt5(genebank登入号：mh299949.1)的同源性最高，为99.46％，故鉴定该菌株为芳香镰孢属真菌。

实施例4：芳香镰孢属真菌“hnu066”的系统进化分析

将实施例4中得到的its序列在ncbi中进行的blast检索，下载与之最相近的已知菌种its序列，用于构建系统发育树。采用clustalx1.83进行多序列比对，比对结果利用mega6.0软件并采用maxiumlikelihood统计学方法，bootstrap值设置为1000，使用tamura-neimodel碱基替换模式，构建基于rdnaits序列的系统发育树。使用mega6.0软件中的p-distances法计算遗传进化距离。具体的系统进化树如图4所示。

实施例5：芳香镰孢属真菌“hnu066”真菌发酵及填料制备

“hnu066”真菌经pda固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基；于发酵罐中每一轮培养时间72h；添加含有葡萄糖0.5g，k2hpo40.5g，kh2po41.5g，(nh4)2so40.5g，nacl0.5g，mgso40.2g，cacl20.05g，feso40.02g，补水至1000ml，ph值调整至6.5左右的液体培养基；将发酵液置于4度冷冻离心机，3000×g，离心20min,弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8g/l的真菌悬液。将“hnu066”悬液吸附于填料上，完成富含“hnu066”真菌的填料制备。

实施例6：“hnu066”真菌提升生物滴滤反应器对含硫化氢废气的吸收清除效率生物滴滤塔反应器的工作参数：设计废气风量8000m³/h，空塔气速1m/s，塔径1800mm，塔高9000mm，喷淋密度15m³/(m²·h)，填料高度1500mm×2，停留时间7s。

设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用原始活性污泥和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测一个工作日周期内，两组设备对含硫化氢废气吸收清除效率的差异。选取两套设备启动20天后的第21个工作日，取样测定所需参数。在一个工作周期内，选取上午8点-晚上22点之间8个时间点，提取输入口和输出口的废气样本，测定硫化氢含量，单位为mg/m³。对照组生物滴滤塔反应器输入口的废气含硫化氢浓度在33.2-41.4mg/m³之间，输出口的废气含硫化氢浓度在0.78-1.54mg/m³之间，硫化氢的清除率在96.2％～97.8％之间。处理组生物滴滤塔反应器输入口的废气含硫化氢浓度在36.2-41.2mg/m³之间，输出口的废气含硫化氢浓度在0.23～0.63mg/m³之间硫化氢的清除率在98.2％～99.4％之间。处理组生物滴滤塔反应器对含硫化氢废气的清除效率显著高于对照组。

实施例7：“hnu066”真菌缩短生物滴滤塔反应器启动时间

设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用原始活性污泥和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测从开始第一天到启动后第20天的含硫化氢废气清除效率。取样时间固定为每天上午8点，提取输入口和输出口的废气样本，测定硫化氢含量，单位为mg/m³。所测得的数据见表格1。

表1的结果表明，同样的测定条件下，处理组的生物滴滤塔反应器从18天开始达到96％以上的效率，而对照组的生物滴滤塔反应器从第16天开始达到96％以上的效率。我们的数据表明，“hnu066”真菌可以缩短生物滴滤塔反应器启动时间。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>微色二孢属真菌hnu107及其氨气废气降解中的应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>560

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>1

tggggcattcctacctgatccgaggtcaacattcagaagttggggttttacggcatggcc60

gcgccgcgttccagttgcgaggtgttagctactacgcaatggaggctgcagcgagaccgc120

caatgtatttcgggggcggcaccgccagaaggcagagccgatccccaacaccaaacccgg180

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