副干酪乳杆菌株LBP-YE01、其培养物、其菌液、传代菌株挑选和保藏方法及其应用与流程

本发明属于微生物培养、繁殖技术领域，具体涉及副干酪乳杆菌株lbp-ye01、其培养物、其菌液、传代菌株挑选和保藏方法及其应用。

背景技术：

副干酪乳杆菌是国家卫生部指定能添加于食品的有益菌种之一，大部分菌株的耐受性很好。但是大部分菌株在37.5℃的环境下培养后失活率比较高，在人体胃肠道内强酸、胆盐和人体消化酶环境无活性。

技术实现要素：

发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于能够提供使乳酸菌满足人体和动物消化道系统生存并繁殖，以发挥其有益菌群的作用。本菌株的标准繁殖温度是42～45℃，在100℃能存活5分钟以上，故能作为补充人体胃肠道的有益菌优选菌株。

本发明的目的在于公开了一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01。

本发明第二个目的在于公开了上述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物。

本发明第三个目的在于公开了上述副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液。

本发明第四个目的在于公开了上述副干酪乳杆菌株lbp-ye01传代菌株挑选和保藏方法。

本发明第五个目的在于公开了副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物和菌液的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01，cgmccno.15360。

上述技术方案所述的一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01，其中：该菌株耐高温，最佳培养繁殖温度42～45℃，在100℃的环境下能存活5分钟以上。

一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物，其中：所述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物是在由大豆渣和糯米组成的菌体培养基中培养副干酪乳杆菌株lbp-ye01得到，培养温度为10℃-20℃，培养时间为10-50天；所述大豆渣和糯米的重量百分比分别为：大豆渣70％-90％、糯米10％-30％。本技术方案中副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物(简称a产物)，a产物中副干酪乳杆菌的数量>1.5×10⁷cfu/g。

一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液，其中，所述菌液通过下述方法制备：将水和麦芽糖添加到上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物，在42℃-45℃下培养1-2天，过滤后得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液；

所述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物、水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物1份、水3-30份、麦芽糖0.3-0.5份。本技术方案中副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液(简称b产物)过滤得到的b产物中副干酪乳杆菌数量>2×10⁷cfu/ml。

一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01传代菌株挑选和保藏方法，其特征在于，所述挑选和保藏方法包括下述步骤：

从上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液中取10ml菌液于无菌试管内在100℃水浴中浸泡5分钟后，再移取1ml菌液至无菌平皿内，将冷却至48℃的mrs琼脂培养基倾注于平皿约15ml，转动平皿混合均匀后在恒温培养箱36±1℃厌氧培养72h；(从移取1ml菌液到平皿倾注15分钟内完成)；

培养完成后，取出平皿，在单个菌落中用接种环挑取菌落，采取斜面接种法接种6～10支无菌斜面mrs琼脂培养基试管，接种后的试管斜面放入36±1℃厌氧培养72h后采用标准的真空冷冻干燥保藏法保藏菌种；

所述mrs琼脂培养基是通过下述方法制备：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温801ml、k2hpo4·7h2o2g、醋酸钠·3h2o5g、柠檬酸三铵2g、mgso4·7h2o0.2g、mgso4·4h2o0.05g和琼脂粉15g加入到1000ml蒸馏水中，加热溶解，调节ph至6.2±0.2，分装后121℃高温灭菌15min～20min。

上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物在作为人和动物口服饮品中的应用。

上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在作为人和动物口服饮品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明中副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液是由副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物在42℃-45℃下培养得到的，因此本发明的饮品人体消化道的条件下能够具有很好的生物活性。

2、由于本发明的副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人体消化道内具有很好的生物活性，因此有助于改善人体的肠胃功能。

附图说明：

1.图1为副干酪乳杆菌在mrs培养基平皿内的菌落图。

2.图2为在3000—4000倍的显微镜上观测的副干酪乳杆菌的形态。

3.图3为副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人工胃液中的生长情况。

4.图4为副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人工肠液中的生长情况。

5.图5为副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液对胆盐的耐受性。

6.图6为副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液的耐盐能力。

菌株保藏信息：本发明副干酪乳杆菌株lbp-ye01，分类命名为副干酪乳杆菌lactobacillusparacasei，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.15360，保藏日期为2018年2月27日。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明副干酪乳杆菌株lbp-ye01、其培养物、其菌液、传代菌株挑选和保藏方法及其应用作进一步的说明。

实施例1：副干酪乳杆菌株lbp-ye01的制备或分离：

1、野外取样，在我国黑龙江省野外的树林内，在阴暗、潮湿的地方挑选到生成出金针菇的树木或者枯木。在金针菇的根部与树皮和土壤之间的混合培养基中采集100g左右的混合物(不是每次取样都会得到本发明的副干酪乳杆菌株，故而要大量采集、挑选。)

2、制备样液，此混合物置于1l的锥形瓶内，加入矿泉水500ml带回到微生物实验室内，在室温25℃左右充分搅拌(2h-3h)后，用200目滤布过滤后得到滤液于1l锥形瓶，将此滤液500ml置于100℃水中充分震荡15分钟。

3、培养在超净工作台上，取滤液1ml置于无菌平皿内，将准备好的约48℃的mrs琼脂培养基倾注于平皿约15ml，转动平皿混合均匀后在恒温培养箱36±1℃厌氧培养72h。

4、挑选、纯化在培养皿中观察菌落形态，副干酪乳杆菌在mrs培养基平皿内的形态(如图1所示)，找到此菌落后，用接种环挑取少量菌体至试管mrs斜面培养基上。

5、纯培养试管mrs斜面在36±1℃恒温培养箱中，倒置培养72h获得纯培养。

6、检测将获得的纯培养的试管mrs斜面送到专门的机构进行菌种测定，评测是否为副干酪乳杆菌种。

7、扩培将获得的纯培养菌用接种环接种到大豆渣70％与糯米粉30％的混合培养基中，10-20℃培养20天，再转入0-5℃低温培养180天左右即可。

实施例2：副干酪乳杆菌株lbp-ye01的鉴定：

1、菌株的形态观测：用接种环在mrs斜面上挑取少许菌置于载玻片上，用无菌水稀释，然后盖上盖玻片，在3000-4000倍的显微镜上观测，结果如图2所示，此菌种为杆状，长度约10μm。

2、本发明生产的副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液(商品名：植物乳酸菌风味饮品2#)送至“深圳市计量质量检测研究院”进行菌种检验，“深圳市计量质量检测研究院”出具的编号为“wt171136752”《检验报告》指出：检出副干酪乳杆菌(鉴定率为99.9％)。

3、申请人将本发明菌株lbp-ye01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行保藏，保藏编号为cgmccno.15360；同时经“中国科学院微生物研究所”进行g+cmol％含量测定，“中国科学院微生物研究所”出具的(2018)微检字第224号检测鉴定报告指出：送检菌种(菌株编号：lbp-ye01)基因组dna的g+cmol％＝45.28％。由此可见本发明菌株的g+cmol％含量测定为相似度45.28％同一种的不同菌株其g+cmol％小于3％-4％，最高不超过5％。因此报告可说明同种不同株的副干酪乳杆菌。

实施例3：副干酪乳杆菌株lbp-ye01传代菌株挑选和保藏方法：

为了保证每一代菌株都有相同的效能，需要对传代菌株进行挑选和保藏，本发明中副干酪乳杆菌株lbp-ye01传代菌株挑选和保藏方法如下：

从副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液中取10ml菌液于无菌试管内在100℃水浴中浸泡5分钟后，再移取1ml菌液至无菌平皿内，将冷却至48℃的mrs琼脂培养基倾注于平皿约15ml，转动平皿混合均匀后在恒温培养箱36±1℃厌氧培养72h；

培养完成后，取出平皿，在单个菌落中用接种环挑取菌落，采取斜面接种法接种6～10支无菌斜面mrs琼脂培养基试管，接种后的试管斜面放入36±1℃厌氧培养72h后采用标准的真空冷冻干燥保藏法保藏菌种；

所述mrs琼脂培养基是通过下述方法制备：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温801ml、k2hpo4·7h2o2g、醋酸钠·3h2o5g、柠檬酸三铵2g、mgso4·7h2o0.2g、mgso4·4h2o0.05g和琼脂粉15g加入到1000ml蒸馏水中，加热溶解，调节ph至6.2±0.2，分装后121℃高温灭菌15min～20min。

传代菌株挑选和保藏中使用的斜面接种方法：斜面接种是从已长好的菌种平板上挑取少量菌种移植到一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。在菌种扩大培养和菌种保藏时常采用斜面接种法，斜面接种使用的接种工具为接种环。

传代菌株挑选和保藏中使用的真空冷冻干燥保藏法：使微生物在低温(-70℃左右)下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分，使菌种始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，是迄今为止最有效的菌种保藏方法。具体操作细则：所用的菌种要注意其纯度，不能有杂菌污染，用无菌吸管吸取2～3ml脱脂牛奶加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌苔刮下，轻轻搅动，使其均匀的悬浮在牛奶内成菌悬液，注意切勿将琼脂刮到牛奶中。

实施例4：副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物的制备：

称取大豆渣75g、糯米25g混匀，制成菌体培养基，在菌体培养基中接种副干酪乳杆菌株lbp-ye01，在15℃的温度下，培养25天，得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物。

实施例5：副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物的制备：

本实施例与实施例4相同，区别在于：大豆渣为70g、糯米为30g；在20℃的温度下，培养10天，得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物。

实施例6：副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物的制备：

本实施例与实施例4相同，区别在于：大豆渣为90g、糯米为10g；在10℃的温度下，培养50天，得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物。

实施例7：副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液的制备：

将水和麦芽糖添加到实施例4制备得到的副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物中，在35℃下培养1天，过滤后得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液；

所述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物、水和麦芽糖之间的重量关系为副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物1kg、水5kg、麦芽糖0.5kg。

实施例8：副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液的制备：

将水和麦芽糖添加到实施例5制备得到的副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物中，在40℃下培养2天，过滤后得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液；

所述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物、水和麦芽糖之间的重量关系为母菌及培养物湿粉1kg、水15kg、麦芽糖0.4kg。

实施例9：副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液的制备：

将水和麦芽糖添加到实施例6制备得到的副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物中，在45℃下培养1天，过滤后得到副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液；

所述副干酪乳杆菌株lbp-ye01培养物、水和麦芽糖之间的重量份为母菌及培养物湿粉1kg、水20kg、麦芽糖0.3kg。

以下通过具体实验例来说明本发明副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液(植物乳酸菌风味饮品)所具有的有益效果：

实验例1：副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人体肠道内的活性检测：

一、材料：

1、主要仪器与设备：

数显酸度计ph350(上海精密科学仪器有限公司)，生物安全柜bsc-1000a2(苏净集团安泰公司)，dnp-9272型生化培养箱(上海申贤恒温设备厂)，agilent1260型高效液相色谱(美国安捷伦公司)，dsx-280b立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

2、培养基：

mrs培养基

3、试剂：

胃蛋白酶/胰蛋白酶(分析纯)，牛胆盐(分析纯)，nacl(分析纯)，葡萄糖(分析纯)，蛋白胨/牛肉粉/酵母粉(生化试剂)，磷酸氢二钾/柠檬酸三铵(分析纯)，醋酸钠(分析纯)，硫酸镁/吐温80(分析纯)，硫酸锰(分析纯)。

二、方法：

1、人工胃肠液耐受性：

(1)、人工胃液的配置：

用盐酸调整蒸馏水的ph值至2.5、3.5、4.5，加入胃蛋白酶，使其质量浓度为1g/100ml，用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到人工胃液。

(2)、人工肠液的配置：

取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.4％氢氧化钠溶液调整ph值至6.8，另取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，用孔径0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，制得人工肠液备用。

(3)、试验方法：

副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液，将其分别转入人工胃液及人工肠液中，37℃恒温培养。分别在0、1、2、3小时，对人工胃液中样品取样，在0、1、2、3、4小时对人工肠液中样品进行取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。

2、耐胆盐试验：

制含有牛胆盐(0.03、0.3、.0.5/100ml)的mrs液体培养基，灭菌(121℃20min)后备用。以不含牛胆盐的mrs液体培养基作为对照。副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液转接至以上培养基中，接种量为1％(v/v),37℃恒温培养。分别在在0、1、2、3、4小时处取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液存活率的计算公式如下：

3、耐高盐试验：

含有nac1(1、2、3、4、5g/100ml)的mrs液体培养基，灭菌(121℃20min)后备用。以不含有nac1的mrs液体培养基作为对照。将副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液转接至以上培养基中，接种为1％(v/v)，37℃恒温培养。在24h处取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。

三、结果分析：

1、人工胃肠液耐受性结果：

益生菌通常有食物携带或以制剂的形式口服，在通过胃肠道的过程中，其存活性会收多种因素如胃酸、胃蛋白酶及胰蛋白酶等的影响。所以，益生菌要活着到达下部肠胃并发挥作用，就必须能耐受胃及上部肠道的苛刻环境而活着到达目的地(一般为大肠)，定植后发挥其生理作用。副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人工胃液及人工肠液中的耐受性试验结果分别见图3和图4。

通常情况下，人体胃液的ph值为2.5-3.5，实物尤其是流体一般需要1-2h的时间通过胃部。饮品植物乳酸菌液b在ph2.5、3.5和4.5的人工胃液中培养3h的过程中，其活菌数较0h处稍有变化，变化不显著(p＞0.05)，说明该菌株在人工胃液中具有较好的耐受性。

副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人工肠液作用4h的过程中，其活菌数较0h处无显著变化(p＞0.05)，说明该菌株在人工肠液中具有较好的耐受性。

2、耐胆盐性能：

小肠胆盐浓度的波动范围通常为0.03～0.3g/100ml，食物一般会在小肠中停留1-4h。由图5可知，胆盐对饮品植物乳杆菌液b的生长有一定的抑制作用，且随胆盐浓度的增加，抑制作用增强。在含有0.03g/100ml胆盐的mrs液体培养基中，随作用时间的延长，活菌数成增长趋势。在含0.3、0.5g/100ml胆盐的mrs液体培养基中作用1h后，活菌数均显著降低(p＜0.05)。1h以后，随作用时间的延长，菌落总数缓缓增加，在作用4h后保持可较高的存活率(95％～85％)及活菌数(＞10⁶cfu/ml)，能够满足益生菌发挥有效作用对菌浓度有要求(一般为10⁶～10⁹cfu/ml)。

由以上结果可见，副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液对人体生理浓度范围内的胆盐有较好的耐受性。

3、耐高盐试验结果：

微生物最适合在等渗溶液中生存，如果将其置于低渗溶液中，菌体会因呼吸膨胀而破裂；在高渗环境中，菌体会因细胞脱水而发生质壁分离。然而，微生物在长期的进化过程中形成了适应渗透压变化的调节机制，大多数耐盐微生物可通过控制胞内相容性溶质的浓度来维持渗透压的平衡。人体胃肠道中nacl浓度在1.00～4.00g/100ml的范围内波动。本实验对副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液的耐盐能力进行评定，结果如图6所示。

由图6可以看出，副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在含有不同质量浓度(1、2、3、4、5g/100ml)nacl的mrs液体培养基中培养24h后，其活菌数与不含nacl对照组相比稍有变化，变化不显著(p＞0.05)，活菌数维持在10⁹cfu/ml以上。

由此可见，副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在肠道的高盐环境中，能够有效地消除高渗透压所带来的不利影响，维持菌体渗透压的相对平衡，具有较强的耐盐能力。

综上，副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液在人工胃液及人工肠液中分别作用3h和4h的过程中，其活菌数较0h处变化不显著，具有较好的耐受性。在胆盐质量浓度为0.3～0.5g/100ml的mrs液体培养基中作用4h，存活率分别为95％～85％，保持了较高的活性。在nacl质量浓度为5g/100ml的mrs液体培养基中培养24h后，其活菌数较不含nacl的对照相比变化不显著。可见副干酪乳杆菌株lbp-ye01菌液对人体的胃肠道逆环境有较好的耐受性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。