一种根瘤菌及其菌剂和应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种根瘤菌及其菌剂和应用。
背景技术：
：抗生素是一种低到中等分子量的化合物，具有多种化学和生物学特性。抗生素是用来治疗细菌感染的药物。抗生素广泛应用在规模化畜禽养殖过程中的动物，包括四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基类等。中国每年生产约21万吨抗生素，约占世界总量的60％，包含了36种不同的抗生素化合物，其中过半的抗生素被用于畜禽养殖业，畜禽粪便中残留抗生素伴随着肥料进入农田。据报道，几乎90％的畜牧和家禽使用的抗生素都是在亚治疗浓度下使用的，其中70％是为了预防疾病，30％是为了促进生长。应用于畜禽的抗生素主要通过排泄物、污水灌溉和污泥堆肥等直接和间接排放进入环境，对自然生态系统产生不利影响。至此，抗生素在人类和动物的广泛使用下，对生态系统和人类健康的负面影响引起了人们的极大关注。抗生素对环境的污染可从几个方面发生，如药品生产过程、丢弃未使用的药品和容器等，或施用粪肥和废渣。环境中的抗生素残留不仅改变了环境微生物群落的结构和丰度，而且影响了微生物群落的能力。抗生素存在和持久性造成了严重的环境污染问题。近年来，由于环境中耐药性细菌的出现，残留抗生素在环境中的潜在影响等引起的一系列环境问题已成为全球关注的焦点。长期接触低毒性和亚毒性的抗生素可改变微生物生态，促进抗生素耐药性细菌的发展和传播。另外，对水生物种的毒性影响，甚至可以通过食物链直接威胁到人类健康。目前，由于抗生素特性的多样化，利用自然界的微生物降解可能是抗生素消减所必需的。红霉素属于大环内酯类抗生素，具有很强的抗菌作用，应用广泛。来自孟加拉国、印度、印度尼西亚和塔兰的研究报告，在海产养殖水中检测到红霉素，其浓度达到180ng/l，美国环境保护署(usepa)在2009年首次将红霉素列为饮用水需要优先检测和控制的候选污染物之一。现有的生物处理工艺如曝气生物滤池，只能消减废水中的微量红霉素，更有效地降解环境中的红霉素残留还要依靠特定的微生物。迄今为止，国内外对微生物降解红霉素的研究较少。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题提供了一种能够高效降解红霉素的根瘤菌及其菌剂和应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种根瘤菌，命名为rhizobiumsp.ery-6，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm2019729，保藏日期为2019年9月17日。第二方面，本发明提供了上述根瘤菌在降解红霉素中的应用。第三方面，本发明提供了一种微生物菌剂，包含上述根瘤菌。第四方面，本发明提供了上述微生物菌剂的制备方法，将所述根瘤菌接种于培养基中得到所述微生物菌剂。进一步，所述培养基为lb培养基或以红霉素为唯一碳源的无机盐培养基。第五方面，本发明还提供了上述微生物菌剂在降解红霉素中的应用。第六方面，本发明提供了一种降解红霉素的方法，向含有红霉素的水样中添加上述微生物菌剂，对水样中的红霉素进行降解。进一步，降解条件为：温度为30-35℃，ph为7-7.0，120r/min振荡培养。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的根瘤菌rhizobiumsp.ery-6对红霉素具有极强的降解能力，能够以红霉素为唯一碳源进行生长，在48h内对无机盐培养基中100mg/l的红霉素的降解率能够达到79.78％，对无机盐培养基中1000mg/l的红霉素的降解率高达37.3％，同时还可以降解罗红霉素、泰乐菌素和氯霉素，具有良好的开发应用前景。附图说明图1为本发明根瘤菌rhizobiumsp.ery-6的形态照片，其中1a为菌落形态，1b和1c为透射电镜下单个细菌形态；图2为本发明根瘤菌rhizobiumsp.ery-6的16srdna凝胶电泳图；图3为本发明根瘤菌rhizobiumsp.ery-6的系统发育树；图4为本发明根瘤菌rhizobiumsp.ery-6的生长曲线；图5为培养时间对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响；图6为红霉素初始浓度对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响，其中图6a底物浓度分别为10、30、50、70、90、110mg/l，图6b底物浓度分别为10、50、100、200、400、800、1000mg/l；图7为温度对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响；图8为转速对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响；图9为ph值对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响；图10为外加碳氮源对根瘤菌rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实验材料红霉素降解菌分离的土壤取自浙江省德清市一家生产有机肥公司内，长期堆放受红霉素污染的鸡粪场地的土壤。实验试剂及仪器ultimate3000型高效液相色谱仪(hplc)，c18色谱柱(250×4.6mm，5μm，waters，usa)，uv-5100型紫外分光光度计(上海元析)，thz-98ab型摇床(上海一恒)，dhp-9082型恒温培养箱(上海沙鹰)，yxq-50sii型高压灭菌锅(上海博迅)，ds-5510dth型超声波清洗机(上海生析)，mini-15k型高速离心机(杭州奥盛)，yr-ptb型真空泵(上海亚荣)，0.22μm针筒式微孔滤膜(天津津腾)。红霉素(纯度98％，源叶生物)，乙腈(色谱纯，tedia，德国)，甲醇(色谱纯，tedia，德国)，磷酸二氢铵(分析纯，麦克林)，其余化学药品均为分析纯试剂，实验用水为哇哈哈纯净水，millipore制备的超纯水。培养基微量元素溶液(g/l)：fecl31.6g，cocl2·6h2o0.1g，mncl2·4h2o0.425g，zncl20.05g，nicl2·6h2o0.01g，cuso4·5h2o0.015g，h3bo30.05g，na2moo4·2h2o0.01g，cacl20.05g，蒸馏水定容至1000ml。无机盐液体培养基：nh4cl1g/l，kh2po40.5g/l，k2hpo41.5g/l，mgso40.2g/l，nacl1g/l，2ml/l微量元素溶液，加超纯水至1000ml。ph7.0，121℃灭菌30min。lb液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加超纯水至1000ml。ph7.0，121℃灭菌30min。固体培养基：在液体培养基中加入1.5％的琼脂。红霉素的液相色谱检测条件：ultimate3000型高效液相色谱仪dad检测器，色谱柱为xterrarpc18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为0.02m的ph3.0的磷酸二氢铵(a相)/乙腈(b相)，洗脱程序见表1，流速为1ml/min，柱温35℃，进样量20μl，检测波长210nm。根据线性回归方程计算出红霉素的含量，并采用以下公式计算降解率：降解率＝(对照样残量-实样残量)/对照样残量×100％表1红霉素液相测定梯度洗脱程序实施例1红霉素降解菌的筛选和鉴定1、红霉素降解菌的驯化、分离、纯化在装有100ml无机盐培养基的锥形瓶中加入10g土壤，同时加入红霉素50mg/l，酵母膏0.2％，葡萄糖0.1％，30℃、120r/min振荡培养3天；补加100mg/l红霉素，30℃、120r/min振荡培养3天；补加100ml无机盐培养基和100mg/l红霉素，30℃、150r/min振荡培养3天；补加100mg/l红霉素，30℃、120r/min振荡培养3天。经过4轮驯化后的菌液，以10％的接种量接入装有5ml无机盐培养基的试管中，并以梯度压力式驯化法继续进行驯化，红霉素浓度依次为100、200、300、400、500、600、800、900和1000mg/l，以红霉素为唯一碳源，在30℃、120r/min条件下进行避光培养48h。得到驯化后的菌液，于对应红霉素浓度的无机盐固体培养基上划板，放入30℃的恒温培养箱避光培养48h，观察生长情况，挑取单菌落，划线至含1000mg/l红霉素的无机盐固体平板，经过四次分离纯化，得到菌株ery-6的纯培养。2、红霉素降解菌株ery-6的鉴定a、红霉素降解菌株ery-6的形态学特征筛选得到的ery-6在lb固体培养基上培养，菌落形态如图1a所示，菌落呈圆形，直径2-3mm，乳白色，不透明，表面光滑、湿润且边缘整齐。单个菌落形态如图1b和1c所示，该菌有鞭毛，以鞭毛运动，无芽孢。b、红霉素降解菌株ery-6的分子学鉴定取1ml新鲜菌液，离心后收集菌体，然后利用细菌基因组试剂盒提取dna，选用通用引物27f(5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和1492r(5'-tacggtaccttgttacgactt-3')对16srrna基因进行pcr扩增。pcr扩增体系为：dna模板2μl，通用引物27f和1429r各5μl，taq酶0.2μl，dntps(各2.5mm)2μl，10×taqbuffer(mg2+)2.5μl，双蒸水8.3μl。pcr反应条件：94℃时预变性10min，94℃时30s，58℃时30s，72℃时45s共30个循环，最后72℃时延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至有康生物工程有限公司进行测序，其16srdna序列如seqidno:1所示：ctccttacggttaggctacctacttctggtgaaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgcagtcgagttgcagactgcaatccggactacgatcggctttctgagattagctccccctcgcgggttggcaaccctctgtaccgaccattgtattacgtgtgaagccctggccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcccaataaagtgcccaactgaatgatggcaattattggcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtccactttctctttcgagcacctaatgcatctctgcttcgttagtggcatgtcaaggccaggtaaggtttttcgcgttgcatcgaattaatccacataatccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttcacgcgttagctgcgttactaatggattttactccaccaacaactagtagacatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgagcatgagcgtcagtattaggccaggaggctgccttcgccattggtattcctccacatctctacgcatttcactgctacacgtggaattctacctccctctcccatactctagccttgtagtttcaaacgcagttcccaggttgagcccggggctttcacatctgacttacaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttcttatcaaggtaccgtcatcctcacatagtattaatatgtaagttttctttccttgcgaaagagctttacaacccgaaggccttcttcactcacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggcttttaccccaccaactagctaatcagatatcggccgctccattaacgtgaggtccgaagatcccccactttccccctcagggcgtatgcggtattagctaatctttcgactagttatcccccattattggacacgttccgatatattactcacccgttcgccactcgccaccagagagcaagctctccgtgctgccg图2为16sdna凝胶电泳图，经测序，该序列共1392bp，将seqidno:1所示序列与genbank数据库中的序列进行blast分析，菌株ery-6与根瘤菌属(rhizobiumsp.)的多种根瘤菌具有较高同源性，最高达98.05％，使用mega7构建系统发育进化树，如图3所示。综合上述形态特征和分子学鉴定，判断该菌株ery-6属于根瘤菌，命名为根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)。rhizobiumsp.ery-6已经于2019年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为cctccm2019729。实施例2根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)的降解特性a、生长曲线测定将细菌接种至含有1000mg/l红霉素的无机盐液体培养基中，30℃、120r/min条件下培养，不同时间取样，采用分光光度法在600nm波长下测定菌液的od值,并绘制生长曲线，结果如图4所示，48h内为菌的对数生长期，48-72h菌生长速度稍见迟缓，72h后菌生长趋于稳定，推测分光光度法测定的菌液浓度包含死亡后的菌体，总体菌液浓度变化不明显。b、降解曲线将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量，接种于红霉素初始浓度为100mg/ld的无机盐培养基中，在30℃，ph7.0，120r/min的条件下振荡培养，每隔8h检测溶液中红霉素浓度。由图5可知，随着培养时间的延长，红霉素降解率不断增大，0-8h降解效果不明显，8-24h快速增长，由2.23％增至31.44％，其后32-48h降解速率再次攀升，其降解率(扣除对照试验中红霉素的自发降解)达到74.1％，48h后趋于稳定。c、底物浓度对rhizobiumsp.ery-6降解能力影响将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量接种于不同底物浓度的无机盐培养基中，红霉素浓度设置为两种梯度，分别为10、50、100、200、400、800、1000mg/l，和10、30、50、70、90、110mg/l。在30℃，ph7.0，120r/min的条件下振荡培养48h，结果如图6a和6b所示，当底物浓度在90-200mg/l时，降解效果最为显著，底物浓度过低或过高都不利于红霉素的降解。当红霉素浓度高达1000mg/l时，降解率为37.3％，说明降解菌ery-6可以在高浓度红霉素条件下生存并产生可观的降解效果。d、温度对rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量，接种于红霉素初始浓度为100mg/ld的无机盐培养基中，将温度设置为20、25、30、35、40和45℃工共6个梯度，ph为7.0，120r/min的条件下振荡培养48h，测定培养液中红霉素的浓度，计算红霉素的降解率(扣除对照试验中红霉素的自发降解)，结果如图7所示，根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)最适宜的生长温度为30-35℃，对红霉素的降解率为79.78％，而20℃时降解率仅为38.3％。e、转速对rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量，接种于红霉素初始浓度为100mg/l的无机盐培养基中，并设置100、120、140、160、180、200r/min六个转速，在30℃，ph7.0的条件下振荡培养48h,结果如图8所示，在转速为120r/min时，红霉素降解效果最为显著，降解率达到75.92％。f、ph对rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量，接种于红霉素初始浓度为100mg/l的无机盐培养基中，调节ph值分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5八个梯度，在30℃、120rpm条件震荡培养48h，结果如图9所示，根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)适合在中性条件下生长，其中，ph为7和7.5时，降解率(扣除对照试验中红霉素的自发降解)相同都为76.3％，当ph为8.5时，菌几乎不生长，相对降解率仅为5.3％。g、外加碳氮源对rhizobiumsp.ery-6降解能力的影响将根瘤菌ery-6(rhizobiumsp.ery-6)按照5％的接种量，接种于红霉素初始浓度为100mg/l的无机盐培养基中，在无机盐培养基中分别加入50mg/l的葡萄糖、蔗糖、酵母膏、蛋白胨作为外加碳氮源，在30℃，ph7.0，120r/min的条件下振荡培养24h后测定红霉素含量，结果如图10所示，在不同碳氮源培养基中生长的rhizobiumsp.ery-6对红霉素的降解率有一定的差异，降解率大小依次为蔗糖>酵母膏>葡萄糖>蛋白胨。在碳源为50mg/l蔗糖的条件下，培养基中100mg/l的红霉素在24h内的相对降解率达到49.66％，高于无外加碳氮源的平均相对降解率31.44％，结果表明外加碳氮源有利于红霉素的降解。h、rhizobiumsp.ery-6对其他抗生素的降解能力分别在无机盐中添加罗红霉素、泰乐菌素、氯霉素、土霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素和恩诺沙星作为唯一碳源，各种抗生素的浓度均为50mg/l,按照5％的接种量接种根瘤菌rhizobiumsp.ery-6，在ph＝7.0、30℃、120/min条件下振荡培养24h，结果如下表所示：抗生素种类生长情况罗红霉素+泰乐菌素+氯霉素+土霉素-四环素-庆大霉素-卡那霉素-恩诺沙星-其中“+”表示可以生长，“-”表示无法生长。根瘤菌rhizobiumsp.ery-6可以以罗红霉素、泰乐菌素和氯霉素为唯一碳源进行生长，不断加大抗生素的浓度，测定根瘤菌rhizobiumsp.ery-6对三种抗生素的耐受浓度，分别为1000mg/l、100mg/l和500mg/l。测定根瘤菌rhizobiumsp.ery-6对氯霉素的降解效率，在以氯霉素为唯一碳源的无机盐培养基中，根瘤菌rhizobiumsp.ery-6在48h内对无机盐培养基中500mg/l的氯霉素的降解率为30.6％，具有优异的降解效果。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江农林大学<120>一种根瘤菌及其菌剂和应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1392<212>dna<213>根瘤菌(rhizobiumsp.)<400>1ctccttacggttaggctacctacttctggtgaaacccactcccatggtgtgacgggcggt60gtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacatgctgatccgcgattactagcgattc120cgacttcatgcagtcgagttgcagactgcaatccggactacgatcggctttctgagatta180gctccccctcgcgggttggcaaccctctgtaccgaccattgtattacgtgtgaagccctg240gccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcag300tcccaataaagtgcccaactgaatgatggcaattattggcaagggttgcgctcgttgcgg360gacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtccact420ttctctttcgagcacctaatgcatctctgcttcgttagtggcatgtcaaggccaggtaag480gtttttcgcgttgcatcgaattaatccacataatccaccgcttgtgcgggcccccgtcaa540ttcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttcacgcgttagct600gcgttactaatggattttactccaccaacaactagtagacatcgtttagggcgtggacta660ccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgagcatgagcgtcagtattaggcc720aggaggctgccttcgccattggtattcctccacatctctacgcatttcactgctacacgt780ggaattctacctccctctcccatactctagccttgtagtttcaaacgcagttcccaggtt840gagcccggggctttcacatctgacttacaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccagtaa900ttccgattaacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtg960cttcttatcaaggtaccgtcatcctcacatagtattaatatgtaagttttctttccttgc1020gaaagagctttacaacccgaaggccttcttcactcacgcggcatggctggatcaggcttt1080cgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagt1140cccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggctttta1200ccccaccaactagctaatcagatatcggccgctccattaacgtgaggtccgaagatcccc1260cactttccccctcagggcgtatgcggtattagctaatctttcgactagttatcccccatt1320attggacacgttccgatatattactcacccgttcgccactcgccaccagagagcaagctc1380tccgtgctgccg1392当前第1页1 2 3