一种防控茄果类蔬菜病毒病的微生物菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防控茄果类蔬菜病毒病的木霉、 芽孢杆菌复合微生物菌剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国农业结构调整步伐的加快和人民生活水平的提高，蔬菜品种的多样化及 周年均衡供应的需求日益增强，我国蔬菜生产的规模不断扩大，产量稳步上升，已成为我国 种植业中仅次于粮食的第二大农作物。据农业部农情统计，2009年我国蔬菜种植面积占全 球的43%，总产量占世界的49. 6%。总产量及出口量均居世界第一，堪称世界第一蔬菜大国。
[0003] 但是随着我国蔬菜生产的发展，栽培模式的多样性，蔬菜栽培种类和品种的丰富 性，尤其是栽培环境的多样化，导致某些次要病害上升，病原菌寄主范围扩大，产生了许多 亟待研究的新病害，一些新老病害交替为害，这些都严重制约着我国蔬菜产业的发展。其中 茄果类蔬菜病毒病，均发生较为严重，造成严重减产、甚至绝收，已成为蔬菜生产的限制性 障碍。目前防治该类病害仍主要采用化学药剂，常常刚用完药就采收销售，不仅造成蔬菜污 染，同时还极易造成抗药性问题。因此研发安全与环境相和谐的微生物农药成为必然，其中 木霉、芽孢杆菌这类有益微生物，由于其具有较强的诱导抗性、广谱抗病能力和调节微生态 作用，而被研究用于植物病害生物防治和改善作物生长。
[0004] 木霉、芽孢杆菌是自然界中普遍存在的真菌和细菌，在土壤、植物根围、叶围及种 子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉、芽孢杆菌是植物病原真菌的寄生 菌或措抗菌，如哈茨木霉（7 1. Aarzia/??)、钩状木霉（71. Asaza ?ω?)、绿色木霉（71. κ/riofe)、 枯草芽抱杆菌（a野ioJi识/e/acieft?)、解淀粉芽抱杆菌（汉a野ioJi识/e/acieft?) 和多粘芽孢杆菌（汉可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉、芽孢杆菌在生 防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉、芽孢杆菌制剂。如以防 治李属果树银叶病（iereiM? /wr/wreiM?)的木霉制剂在西欧已商品化生产；以 色列的Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂，商品名 Trichodex，剂型为25%可湿粉，它可以用于防治灰霉病菌ciflerea)、菌核病菌 scJeiOiior·)、叶霉病（C/at/oSjOari· 等病害。21 世纪被称为环保 世纪，化学药剂的应用逐步受到限制，因此对蔬菜病害的生物防治研究自然称为热点问题。
[0005] 本发明正是基于以上原因，以目前蔬菜为害较为严重，又缺乏生物防治手段的的 茄果类蔬菜病毒病为靶标，从微生物资源中寻找具有高效诱抗、钝化病毒等活性的微生物， 拟为研究开发新型生物菌剂寻找新的资源。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种防控茄果类蔬菜病毒病的深绿木霉、解淀粉芽孢杆菌制剂及 其制备方法，可以用于防控茄果类蔬菜病毒病，解决化学农药防治带来的农药残留、抗药性 和环境污染问题。本发明具有高效、性能稳定、可规模化生产的微生物菌剂，可用于防控 TMV、CMV、TYLCV等茄果类蔬菜病毒病。为实现此目的，本发明公开了如下的技术内容： 一株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的深绿木霉菌株，其特征在于该菌株为 深绿木霉Trl208 ( airoKiriofe)，已于2012年11月15日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 6828。保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院中科院微生物研究所。
[0007] -株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在 于该菌株为解淀粉芽抱杆菌B1126 a野ioJit/i/e/'aciefts1)，已于2012年11月15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 6827。保藏 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
[0008] 本发明保藏的深绿木霉菌株Trl208 ( airoKiriofe)的生理、生化特 性如下： 木霉菌株Tr 1208在PDA平板上生长迅速，菌落在3天内覆盖直径90mm的平板，呈辐射 状，表面疏松平坦；在培养的第3天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈 现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹。显微观察培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横 隔的分枝菌丝构成；产生的分生孢子无隔膜，呈球形，聚成头状排列，单生，细胞壁存在明显 而微小的粗糙突起。
[0009] 本发明保藏的解淀粉芽孢杆菌B1126 (ifeciWiAs a野ioJi识/e/aciefts·)的生理、生 化特性如下： 解淀粉芽孢杆菌B1126菌体污白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革 兰氏染色菌体呈阳性，为革兰氏阳性菌，杆状；接触酶实验阳性；氧化酶实验阴性；葡萄糖 阳性；乳糖阳性；蔗糖阳性。
[0010] 本发明进一步公开了一种深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，是以深绿木霉Trl208 和解淀粉芽孢杆菌B1126菌体为有效活性成分，一种深绿木霉菌剂，其特征在于它是由 保藏号为CGMCCNo. 6828的深绿木霉Tr 1208 ( a iroκ/riofe)和保藏号为 CGMCCNo. 6827的解淀粉芽抱杆菌B1126 a野ioJi识/e/aciefts·)的菌体和它的次 生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活 性成分为5X109cfu/g -SXK^cfu/g，菌体保护剂含量为0· 1~1% (w/w)。
[0011] 本发明优选的，其特征在于它是由保藏号为CGMCCNo. 6828的深绿木霉Trl208 (airoKiriofe)和保藏号为 CGMCCNo. 6827 的解淀粉芽抱杆菌 aazjio)的菌体和它的次生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载 体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为5X 109cfu/g ~2X lOlfu/g，菌体保护剂含 量为 0· 1~1% (w/w)。
[0012] 本发明所述的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其菌体为深绿木霉的分生孢子、 菌丝和厚垣孢子，解淀粉芽孢杆菌的菌体和芽孢，以及农业上可接受载体的混合；农业上可 接受的载体为：硅藻土、碳酸钙、水、小麦粉、木屑、高岭土、不饱和烃类一种或几种的混合 物；所述的菌体保护剂为黄原胶、蔗糖、腐植酸钠、黄腐酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙、山梨酸钾一 种或几种的混合物。
[0013] 本发明更加优选的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分 组成： 深绿木霉Trl208和解淀粉芽孢杆菌B1126含菌量为5X 109cfu/g ~2X 101Qcfu/g ; 黄原胶 〇· 02~0· 1% (w/w); 鹿糖 0· 05~0· 5% (w/w); 腐植酸钠或黄腐酸钾〇. 〇2~0. 2% (w/w); 苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾〇. 〇l~〇. 2% (w/w)。
[0014] 余下量为碳酸钙和硅藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。
[0015] 本发明更进一步公开了深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于 按如下的步骤进行： 1)菌种活化和菌液制备：保藏号为CGMCCNo. 6828的深绿木霉Trl208 ( rricAoi/eiwa aiiwinVe)的菌株，在23~28°C下，在马PDA培养基中活化72h，备用；在23~28°C下，在Η) 培养液中震荡培养72~96h，培养后得到深绿木霉Trl208种子液； 保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽抱杆菌B1126 a野ioJi识/e/aciefts·) 的菌株，30~37°C下，在ΝΑ培养基中活化24h，备用；在30~37°C下，在ΝΑ培养液中震荡培养 24~48h，培养后得到解淀粉芽孢杆菌Β1126菌液； 所述的PDA培养基(或培养液）组成为：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克 (培养液不添加)、蒸馏水1000毫升，自然pH ; 所述的ΝΑ培养基(或ΝΑ培养液）组成为：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2. 5g、15~20 克(培养液不添加)、蒸馏水1000毫升，pH7±0. 5 ; 3)固体发酵培养及菌粉的获得：在固体发酵培养基料中加入水20~45% (w/w)，初始pH 为6. 5~7. 5之间，高温灭菌，然后待温度降到30°C以下，接入步骤2)的深绿木霉Trl208种 子液，再在温度为20~30°C，间隔24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h ;测定发酵培 养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到109 cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料 经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎、过筛后成深绿木霉菌粉； 所述的固体发酵培养基料（w/w)的组成为：麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/ 和木屑77. 1~84%，过磷酸钙0. 5~1%，尿素0. 2~0. 5%，蔗糖0. 2~0. 5%，润水后灭菌备用； 解淀粉芽孢杆菌B1126菌液经过喷雾干燥，获得解淀粉芽孢杆菌菌粉。
[0016] 4)制备深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂：深绿木霉Trl208和解淀粉芽孢杆 菌B1126菌粉；黄原胶0. 02~0. 1% (w/w);蔗糖0. 05~0. 5% (w/w);腐植酸钠或黄腐酸钾 0. 02~0. 2% (w/w);苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾0. 01~0. 2% (w/w)。余下量为碳酸钙和硅 藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。混合制备深绿木霉和解淀粉芽 孢杆菌菌剂含菌量5X 109cfu/g ~2X K^cfu/g。
[0017] 本发明同时也公开了深绿木霉Tr 1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株制备作为防 控茄果类蔬菜病毒病菌剂中的应