一种红球菌株c3、含该菌株的微生物菌剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染物生物强化技术领域，具体涉及一种红球菌及其在废水处理 中的应用红球菌株C3,特别涉及到酚类有机污染物的生物处理。
【背景技术】
[0002] 苯酚属高毒物质，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾 功能，高浓度酚可使蛋白质凝固及引起组织损伤、坏死。在水体中，5~25mg/L的苯酚即可 对鱼类的生存构成威胁。由于苯酚具有致癌、致畸、致突变的潜在毒性，各国都相继提出了 把苯酚列为水中优先控制污染物。含有酚类物质的主要来自于石油炼化、煤焦化厂、煤气 厂，若此类废水未经处理而大量排放，就会造成严重的环境污染，严重危害人体健康和生态 环境。因此，如何有效地处理含酚废水是环境污染防治领域迫切解决的问题。
[0003]目前研究和应用的高含酚类物质的废水处理技术包括蒸馏、液液萃取、吸附、渗透 蒸发、高级氧化和生物处理等。生物处理法是较为经济、实效、无污染转移、操作简便易掌握 的典型工艺技术，也是当今废水处理的主流方法。但由于高浓度酚类物质的存在，导致传 统活性污泥法等生物处理技术，具有污泥驯化时间长、处理效果不稳定、耐冲击性能差等问 题。而向污水处理设施中投加高效降解菌，可以在低成本的前提下大大提高降解效率。
[0004] 近年来，研究在自然环境中具有竞争优势的特种微生物已经成为水处理新的热 点。国内外研究者已经对一些高效降解菌进行了研究，例如，假单胞菌属具有代谢多种化合 物的能力，对例如芳香烃类、芳烃衍生物等化合物具有相当高的降解活性；棒杆菌属是裂解 杂环化合物和碳氢化合物链的主要菌种；节杆菌属可氧化烃类化合物、留体化合物等；这 些高效菌种在难降解有机废水（TNT废水、造纸废水、染料废水和焦化废水等）处理方面具 有广阔的应用前景。
[0005] 包埋固定化微生物技术表现为微生物密度高、具有抗冲击负荷及适应性广的特 点。其生长与分布不会因治理底物的存在而发生改变，而且采用的包埋固定化材料和方法 又有较强的针对性。因此，微生物包埋固定化技术是使微生物得到更广泛、更有效应用的一 种重要手段，其在处理废水领域将有着广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一株可高效降解苯酚的菌株，为含酚废水的治理提供 理论基础和技术支持。
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种利用上述红球菌生产的微生物菌剂。
[0008] -株红球菌株C3,其特征在于，所述的菌株由下述步骤制备而得：
[0009] 按1%接种量吸取一定量的焦化厂废水生物处理系统的活性污泥样品至苯酚的新 鲜富集培养基中振荡培养；富集瓶混浊后，取一定量的培养液转接到增长一定浓度的苯酚 液体培养基中培养；依次类推，逐级提高苯酚浓度至l〇〇〇mg/L ;将经过苯酚浓度为lOOOmg/ L的富集培养基富集后的菌体转接苯酚浓度为1000mg/L无机盐培养基中驯化；采用稀释涂 布和划线的方法，在分离培养基平板上分离筛选以苯酚为唯一碳源和能源的菌株；
[0010] 所述液体富集培养基组分为蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、去离子水和苯酚，其中蛋 白胨：牛肉膏：氯化钠：去离子水的质量比为10:3:5:1000,苯酚浓度根据需要添加；所述 的无机盐液体培养基以苯酚为唯一碳源，组分及质量比为0. 5KH2P04:0. 5K2HP04:NH4N03， 0. 2MgS04:0. 2CaCl2:0. 01FeS04.7H20 :0. 01MnS04 .H20,还包括苯酚，苯酚含量根据需要量加 入，加蒸馏水定容；
[0011] 制备得到的菌株经16SrDNA鉴定为红球菌属Rhodococcussp?，革兰氏染色呈阳 性，脲酶、接触酶阳性，氧化酶、VP反应和甲基红反应阴性；在LB固体培养基上划线分离单 菌落，淡黄半透明，边缘整齐，质地湿润，易挑起；所述的红球菌株C3能以苯酚、吡啶、邻甲 酸为碳源，其在无机盐液体培养基中能够降解l〇〇〇mg/L苯酸。
[0012] 本发明还提供了一种利用上述红球菌株C3生产的微生物菌剂，其活性组分为上 述的红球菌株C3。
[0013] 本发明还提供了一种利用上述红球菌株C3生产的微生物菌剂的制备方法，包括 如下步骤：
[0014](1)将所述的红球菌株C33接种到富集培养基30°C，200r/min条件下培养 24h-48h，以7000rpm速度离心3-5min后得到菌体的对数生长期细胞，并用磷酸盐缓冲液洗 涤2~3次；
[0015] (2)将离心出的菌液加入活性炭吸附，其中活性炭加入量为3~10wt%;
[0016] (3)将PVA加入水中，在90°C水浴条件下完全溶解，PVA与水的重量/体积比为 1:8~10,冷却后加入海藻酸钠、二氧化硅和碳酸钙并混合均匀，PVA:海藻酸钠：二氧化硅： 碳酸钙的重量比为10:3~6:35:0. 2~0. 5,得到PVA凝胶-海藻酸钠凝胶；
[0017] (4)把制得的所述PVA-海藻酸钠凝胶和加入活性炭的菌液混合均匀后，得到菌 体-PVA-海藻酸钠悬液，将菌体-PVA-海藻酸钠悬液低速滴入连续搅拌的含3~5%CaCl2 的硼酸溶液中，所述的硼酸溶液pH呈中性，在4~6°C固定化交联24~90h后取出，形成固 定化颗粒；
[0018] (5)将固定化颗粒于固化剂K2HP04固化2_8h后，用去离子水洗涤2~3次，即得 固定化微生物制剂。
[0019] 本发明还进一步提供了该红球菌株C3在焦化废水或炼油废水或焦油加工废水中 酚类有机污染物的生物处理中的应用。
[0020] 本发明还进一步提供了本发明微生物菌剂在处理含酚废水中的应用，其中包括以 下操作：将所述的微生物菌剂按重量与体积比为3% -10%的浓度加入含酚废水中。。
[0021] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0022] 1)本发明所提供的高效降解菌株源于焦化厂废水生物处理系统的活性污泥，经过 富集驯化及筛选，并通过平板划线分离纯化得到，苯酚等有毒有机物降解效率高。
[0023] 2)本发明制备固定化微生物制剂的方法简便，制得的固定化菌剂有效降解菌浓度 高、菌体不易流失、抗冲击性强。
[0024] 3)与直接投加菌体的生物强化处理工艺相比，具有专一性强、处理效率高、稳定性 强、菌种高纯高效、污泥量少、固液分离效果好、运行管理简单、经济性更好等优点。
【附图说明】
[0025] 图1是菌剂对焦化废水中苯酚的降解的效果；
[0026] 图2是菌剂对焦化加工废水中苯酚的降解的效果；
[0027] 图3是菌剂对炼油废水中苯酚的降解的效果。
【具体实施方式】
[0028] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0029] 实施例1:红球菌株C3菌株的获得及鉴定
[0030] -、菌种的获得
[0031] 菌株源于焦化厂废水生物处理系统的活性污泥。按1 %接种量吸取2ml污泥样品 至200ml苯酚浓度为200mg/L的新鲜富集培养基中，摇床震振荡培养（30°C，200r/min)。富 集瓶混浊后，取2ml培养液转接到苯酚浓度为400mg/L的液体培养基中培养。依次类推，逐 级提高苯酚浓度至l〇〇〇mg/L。将经过苯酚浓度为1000mg/L的富集培养基富集后的菌体转 接苯酚浓度为l〇〇〇mg/L无机盐培养基中驯化。采用稀释涂布和划线的方法，在分离培养基 平板上分离筛选以苯酚为唯一碳源和能源的菌株。
[0032] 牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水 1000ml，苯酚（根据需要量加入）。无机盐液体培养基以苯酚为唯一碳源，具体配方： KH2P040 . 5g,K2HP040 . 5g,NH4N031.Og,MgS040 . 2g,CaCl20. 2g,FeS04 ? 7H20 0.Olg,MnS04 ?H20 0. 01g，苯酚（根据需要量加入），加蒸馏水定容至1L，固体培养基是在此培养基中加入 18~20g琼脂。
[0033] 二、菌株的鉴定
[0034] (1)形态特征：菌体为短杆状
[0035] (2)生理生化特征：革兰氏染色阳性菌（革兰氏染色阳性）；脲酶、接触酶阳性，氧 化酶、VP反应和甲基红反应阴性；在LB固体培养基上生长3天后，菌落大小约2~3mm，淡 黄色，菌落凸起，边缘不规则，菌落表面湿润，半透明。
[0036] (3)1防rDNA序列鉴定
[0037] 菌株16SrDNA序列比对鉴定：离心收集菌体，用试剂盒提取总DNA。使用16SrDNA 正向引物F1:5 ' -AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3 '，反向引物R1:5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ' 进行DNA扩增（PCR)。PCR反应条件：95°C预变性5min，95°C变性45s，55°C退火45s，72°C 延伸90s，30个循环，72°C最终延伸10min。所测序列使用NCBIBlast比对分析，结果显示， 与其序列相似度达到99%的均为Rhodococcussp.，其16SrDNA序列见序列表。结合菌株 的生理生化特性，将其归属于红球菌属（Rhodococcussp.)，编号为C3。
[0038] 实施例2 :红球菌株RhodococcusC3对无机盐培养基中R比啶、邻甲酸的降解
[0039] 挑取红球菌株C3单菌落于3mlLB液体培养基中，30°C、200r/min振荡培养24小 时，获得新鲜菌液。将吡啶、邻甲酚分别加入无机盐培养基中，吡啶、邻甲酚的终浓度分别