一株阿耶波多氏芽孢杆菌及其在丙烯酸降解上的应用的制作方法

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株阿耶波多氏芽孢杆菌(bacillusaryabhattai)cy及其在丙烯酸降解上的应用。

背景技术：

丙烯酸是一种重要的化工原料，广泛应用于油漆、涂料、皮革、纺织、印刷等行业。目前，我国每年丙烯酸的总产量约120万吨，按照每生产1吨丙烯酸就会产生1.2吨废水计算，每年我国将产生约140万吨丙烯酸废水。因此，丙烯酸废水的高效处理已成为工业废水污染控制领域的重要内容。

近年来，国内外在丙烯酸废水处理方面做了大量研究与应用。催化湿式氧化法具有去除效率高、能耗低、二次污染小的优点，是较为清洁的处理技术，但是，存在运行成本高、控制难度大、重金属催化剂潜在的污染等问题；超临界水氧化法具有反应时间短、污染物去除彻底、占地面积小、清洁环保等优势，但是高浓度溶解氧、高温高压带来的设备腐蚀和无机盐沉积是该技术面临的主要问题；纤维吸附法、离子交换纤维法、光电子波分解法等具有反应条件温和、反应速度较快、去除效率较高的特点，但是目前深入研究较少，且处理成本较高，限制了其实际工程应用的推广。利用生物法处理丙烯酸废水具有能耗低、反应条件温和降解效率高等特点，但是国内外对于具有丙烯酸降解能力的菌株研究却鲜有报道。因此，本发明为丙烯酸降解筛选可用菌株，进行生物降解丙烯酸，为丙烯酸废水的处理提供了一种新方法，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株阿耶波多氏芽孢杆菌cy及其在丙烯酸降解上的应用。

本发明采用的技术方案是：一株阿耶波多氏芽孢杆菌，命名为bacillusaryabhattaicy，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：cctccno:m2019526，保藏日期2019年7月5日。

所述阿耶波多氏芽孢杆菌cy菌株的特征为：菌落颜色为微黄色，菌落呈小型单个菌落，菌落内部呈黏液状，有芽孢，不透明，无鞭毛，透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌。该菌株16srdna序列如seqidno.1所示。

一种所述阿耶波多氏芽孢杆菌在丙烯酸降解中的应用。

进一步地，将阿耶波多氏芽孢杆菌cy经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液，所述含菌悬液接种至丙烯酸液体选择培养基中，得到，所述含菌悬液占所述丙烯酸降解液的5vt％。以丙烯酸为碳源，在25℃-40℃、160rpm条件下培养，降解丙烯酸。所述丙烯酸液体选择培养基的组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100～200mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值5.0～9.0。

进一步地，所述碳源还包括辅助碳源，具体为葡萄糖、甘油、酵母或蔗糖，所述丙烯酸降解液中，辅助碳源的碳浓度为100mg·l^-1。

进一步地，所述阿耶波多氏芽孢杆菌cy经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液通过以下方法制备得到：

(1)斜面培养：将阿耶波多氏芽孢杆菌cy接种至斜面培养基，30℃培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值7.0，琼脂18g·l^-1。

(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养18h，获得种子液；所述种子培养基组成为：nacl10g·l^-1，酵母浸粉5g·l^-1，蛋白胨10g·l^-1，溶剂为水，ph值7.0。

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，30℃培养，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值7.0。

本发明具有如下有益效果：本发明提供了一株具有丙烯酸降解性能的阿耶波多氏芽孢杆菌及其降解丙烯酸的应用，该菌株在2d内能对初始浓度为100mg·l^-1的丙烯酸降解率达到99％以上，该降解菌对工业废水中丙烯酸的处理具有重要意义。

附图说明

图1为菌株cy的透射电镜照片；

图2为菌株cy的系统发育树图；

图3为不同辅助碳源下菌株cy的丙烯酸降解性能比较；

图4为不同初始丙烯酸浓度下菌株cy的丙烯酸降解性能比较；

图5为不同温度下菌株cy的丙烯酸降解性能比较；

图6为不同ph下菌株cy的丙烯酸降解性能比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：bacillusaryabhattaicy的分离、纯化及其鉴定

1.bacillusaryabhattaicy的分离及纯化

bacillusaryabhattaicy是从浙江卫星能源有限公司废水处理池污泥中筛选，具体步骤如下：

丙烯酸液体基础培养基，配制方法如下：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph7.0，121℃灭菌20min。

丙烯酸固体选择培养基：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph7.0，同时加入18g·l^-1琼脂，121℃灭菌20min。

取卫星能源公司丙烯酸废水处理池中的污泥，静置24h后，取10ml接种于含100ml无菌水的250ml培养瓶中，30℃，160rpm振荡培养30min，停止震荡后静置2min，取悬浮液5ml接种于含100ml丙烯酸液体选择培养基中，30℃，160rpm振荡培养3d，3d后取悬浮液5ml接种于含100ml新鲜丙烯酸液体选择培养基中，30℃，160rpm振荡培养3d，3次培养后，用无菌水配制成一定浓度的菌液。将所得到的菌液用丙烯酸固体选择培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落即丙烯酸降解菌种，记为菌株cy。

2.菌株cy的鉴定

a、菌株cy的形态特征

菌落颜色为微黄色，菌落呈小型单个菌落，菌落内部呈黏液状，有芽孢，不透明，无鞭毛。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌(图1所示)。它生长最适ph值为7.0，最适温度为30℃。

b、菌株cy的16srrna序列分析

通过16srrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株cy为bacillusaryabhattai。具体步骤如下：

采用3s柱离心式环境样品dna回收试剂盒(v2.2，浙江天科生物科技有限公司)提取和纯化菌株cy的dna，4℃保存。选用细菌的通用引物f27和1492r对纯化的dna进行pcr扩增，引物序列分别为：

f27：5’-agagtttgatcctggctcag-3’

1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’

pcr反应体系为(50μl)：模板dna1.75μl，引物f27和引物r1492各1μl，mgcl2(25mmol·l^-1)3μl，taq酶(5u·μl^-1)0.25μl，10×pcr缓冲液5μl，dntp(2.5mmol·l^-1)4μl，重蒸水34μl。

pcr反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将pcr产物进行测序(浙江天科)，测序结果见序列seqidno：1所示。

将cy的16srdna序列上传到同genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于bacillus属，与bacillusaryabhattaib8w22同源性最高，达到100％，图2为该菌株的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株cy属于bacillusaryabhattai，因此，将该菌株命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(bacillusaryabhattai)cy。

实施例2阿耶波多氏芽孢杆菌cy发酵培养液

(1)斜面培养

将阿耶波多氏芽孢杆菌cy接种至斜面培养基，30℃培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值7.0，琼脂18g·l^-1。

(2)种子培养：从菌体斜面挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养18h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：nacl10g·l^-1，酵母浸粉5g·l^-1，蛋白胨10g·l^-1，溶剂为水，ph值7.0。

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，30℃培养，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值7.0。

由实施例2培养得到的阿耶波多氏芽孢杆菌cy发酵培养液，经18h后的培养，od600达到了1.5，说明具有较高的活性。

实施例3：bacillusaryabhattaicy丙烯酸降解性能检测

1.考察不同辅助碳源下阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的性能

在不同辅助碳源下实施阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的实验，结果表明其最佳辅助碳源为酵母，具体实施方案如下：

分别以葡萄糖、甘油、酵母、蔗糖、乙酸钠为唯一辅助碳源(含碳浓度100mg·l^-1)，按丙烯酸降解液体积浓度5％接种量将od600为1.5的含菌悬液(实施例2方法制备)分别接种于丙烯酸液体选择培养基a(辅助碳源为葡萄糖)、丙烯酸液体选择培养基b(辅助碳源为甘油)、丙烯酸液体选择培养基c(辅助碳源为酵母)、丙烯酸液体选择培养基d(辅助碳源为蔗糖)、丙烯酸液体选择培养基e(辅助碳源为乙酸钠)5种培养基中，所述液体选择培养基的组成均为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，辅助碳源碳浓度100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值为7.0，在30℃，160rpm振荡培养2d，分别获得培养液，采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度，即取1.5ml培养液作为样品，先将样品离心，用5ml一次性针筒注射器抽取上清液，再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物，然后取滤液用高效液相色谱法测出丙烯酸的浓度。

碳源为微生物的生长提供重要的能源，并构成微生物的细胞物质。不同的碳源因其结构和分子量不同，对微生物还原的影响程度也不尽相同。

结果如图3所示，结果表明，所用碳源的化学结构和分子量对还原效率的影响是很大的，阿耶波多氏芽孢杆菌cy对酵母的利用效果最好，降解率为95％；葡萄糖、甘油、蔗糖也能很好促进阿耶波多氏芽孢杆菌cy对丙烯酸的降解，降解效果都能达到90％以上。而乙酸钠是小分子有机酸，菌株cy对其选择利用性较差，降解效果只有62％，

2.考察不同初始丙烯酸浓度下阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的性能

在不同初始丙烯酸浓度下实施阿耶波多氏芽孢杆菌cy的降解实验，结果表明其在丙烯酸浓度100～1000mg·l^-1下都能降解丙烯酸，具体实施方案如下：

以丙烯酸为碳源，按丙烯酸降解液体积浓度5％接种量将od600为1.5的含菌悬液(实施例2方法制备)分别接种于初始丙烯酸浓度分别为100mg·l^-1、200mg·l^-1、400mg·l^-1、600mg·l^-1、800mg·l^-1、1000mg·l^-1的6个液体选择培养基中，所述液体选择培养基中其他物质组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值为7.0，在30℃，160rpm振荡培养2d，获得培养液，采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度，即取1.5ml培养液作为样品，先将样品离心，用5ml一次性针筒注射器抽取上清液，再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物，然后取滤液用高效液相色谱法测出丙烯酸的浓度。

丙烯酸液体选择培养基浓度组成为：结果如图4所示：在100mgl^-1初始丙烯酸浓度下，阿耶波多氏芽孢杆菌cy能降解丙烯酸，降解率为99％，该阿耶波多氏芽孢杆菌cy在其他浓度的丙烯酸中的降解率降低，这是由于丙烯酸本身具有一定的毒性，浓度过高会抑制细胞的生长代谢。

3.考察不同温度下阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的性能

在不同温度下实施阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的实验，结果表明其最佳温度为30℃，具体实施方案如下：

将od600为1.5的含菌悬液(实施例2方法制备)按丙烯酸降解液体积浓度5％分别接种于丙烯酸液体选择培养基中，所述液体选择培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，ph值为7.0，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，160rpm振荡培养2d，获得培养液，采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度，即取1.5ml培养液作为样品，先将样品离心，用5ml一次性针筒注射器抽取上清液，再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物，然后取滤液用高效液相色谱法测出丙烯酸的浓度。

结果如图5所示，数据表明，当温度大于40℃时，微生物的活性明显被抑制。由图可知，阿耶波多氏芽孢杆菌cy的最佳温度为25-40℃，当温度为30℃时，阿耶波多氏芽孢杆菌cy对丙烯酸的降解率达到99.5％。

4.考察不同初始ph条件下阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的性能

在不同初始ph下实施阿耶波多氏芽孢杆菌cy降解丙烯酸的实验，发现ph＝7.0为最佳ph，此时降解率最高，具体实施步骤如下：

按丙烯酸降解液体积浓度5％接种量将od600为1.5的含菌悬液(实施例2方法制备)接种于不同ph值的丙烯酸液体选择培养基(ph值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，所述液体选择培养基组成为：nh4cl540mg·l^-1，k2hpo41000mg·l^-1，kh2po41000mg·l^-1，nacl500mg·l^-1，酵母浸粉1000mg·l^-1，丙烯酸100mg·l^-1，mgso4·7h2o4mg·l^-1，cacl21mg·l^-1，cuso41mg·l^-1，feso41mg·l^-1，mnso41mg·l^-1，溶剂为水，在30℃，160rpm振荡培养2d，获得培养液，采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度，即取1.5ml培养液作为样品，先将样品离心，用5ml一次性针筒注射器抽取上清液，再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物，然后取滤液用高效液相色谱法测出丙烯酸的浓度。

结果如图6所示，当ph为7.0时，菌株cy对丙烯酸的降解效果最好，达到99.8％，当ph为10时，阿耶波多氏芽孢杆菌cy的降解效果下降明显，这是由于ph过高，酶失活，微生物的活性被抑制，说明菌株cy对强碱的环境适应性相对较差。

序列表

<110>浙江树人学院（浙江树人大学）

<120>一株阿耶波多氏芽孢杆菌及其在丙烯酸降解上的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1370

<212>dna

<213>bacillusaryabhattai

<400>1

aagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgt60

aagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgg120

gagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagcta180

gttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcgg240

ccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcc300

gcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgta360

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aggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctac1260

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