一种极端嗜高温菌及其在高温堆肥发酵中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术和环境工程领域，尤其涉及一种极端嗜高温菌及其在高温堆肥发酵中的应用。

背景技术：

人类的活动产生了餐厨等含大量有机物的固体废弃物，如不处理会对环境造成严重污染，近年来逐渐兴起的高温堆肥技术可以有效地将这些固废稳定化。高温堆肥是一种在高温条件下利用微生物生长活动分解有机物使其转变为腐殖质的过程。根据所使用微生物的不同，可分为好养高温堆肥和厌氧高温堆肥，目前国内外普遍采用的是好养高温堆肥技术。相较于厌氧，好氧高温堆肥存在以下几个优点：一、对于同样的有机质，好氧高温堆肥降解更为彻底，即去除率更高。二，在相同时间内，好氧高温堆肥所能降解的有机物的量远大于厌氧高温堆肥，即好氧高温堆肥降解速率更快。三，好氧高温堆肥便于机械操作，在工程上能有效减少人力成本和操作难度。另外，好氧高温堆肥释放的热能不仅能维持反应所需温度，无需外部供热，而且可以有效杀死部分细菌和病毒，减小垃圾的有毒有害性。

高温堆肥技术又称发酵技术，传统发酵温度一般维持在60℃左右，且不宜超过70℃，反应时间可持续10天左右。当温度过高时，微生物不耐热会失活大量死亡，导致发酵速度减慢。根据堆体的反应温度可将发酵分为三个阶段：升温阶段，高温阶段，降温阶段，反应主要在高温阶段进行。

由上可知，目前高温堆肥技术主要限制于高效的极端嗜热功能微生物的缺乏，导致发酵温度难以达到更高。因此有必要不断筛选出更为理想的极端嗜热功能微生物。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种极端嗜高温菌及其在高温堆肥发酵中的应用本发明中所述的菌株gw-2能耐受105℃的高温并保持一定的活性，此外，其也能够在较宽的ph（5-11）和盐度（0-7%）环境中生存并保持较高活性。采用本发明可以大幅提高堆肥温度，加速有机固废的腐质化，节省时间成本。

本发明的具体技术方案为：本发明提供了一种极端嗜高温菌，其命名为gw-2，已在2019年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc18012，微生物分类命名为chelativoranscomposti；所述gw-2的16s核糖体亚基基因序列如seqidno.1所示。

本发明菌株为分离自南京汤山温泉高温热泉环境，经测序鉴定，gw-2菌株16s核糖体亚基基因序列最相似菌株为堆肥噬螯合剂菌属nis3（chelativoranscompostinis3）。其特性如下：

(1)、使用tm培养基进行筛选、传代。（每升tm培养基中含：na2hpo4·12h2o0.48g、kh2po460.0mg、mgcl2·6h2o0.24g、caso4·2h2o45.0mg、0.01m柠檬酸铁溶液0.6ml、微量元素溶液1.0ml、氨三乙酸0.12g、胰蛋白胨2.7g、酵母提取物2.7g、琼脂（配固体培养基）18g、ph7.5，其中1000倍的微量元素溶液每升中含：cocl2·6h2o48.0mg、na2moo4·2h2o27.0mg、cuso4·5h2o27.0mg、h3bo30.54g、znso4·7h2o0.54g、mnso4·h2o2.4g、srcl238.0mg、na2sio34.2mg、naf2.5mg、浓硫酸0.6ml）。

（2）、菌株gw-2为极端嗜热菌，在tm培养基中的生长条件：温度40-105℃（最适90℃），ph5-11（最适8），盐度0-7%（w/v，最适1.5-3.5%）。

（3）、菌株gw-2为革兰氏阳性菌，大小1-3μm。

（4）、菌株gw-2在tm培养基中代时为20min。

（5）、菌株gw-2为堆肥噬螯合剂菌属，对作物、人和动物无害。

传统发酵最高温度一般在60℃，不能超过70℃，否则会造成微生物大量死亡。而本发明中所述的菌株gw-2能耐受105℃的高温并保持一定的活性，此外，其也能够在较宽的ph（5-11）和盐度（0-7%）环境中生存并保持较高活性。采用本发明可以大幅提高堆肥温度，加速有机固废的腐质化，节省时间成本。

作为优选，所述极端嗜高温菌还可以为前述极端嗜高温菌gw-2的培养物或者传代后的培养物。

本发明还提供了一种极端嗜高温菌的突变体，所述突变体为对前述极端嗜高温菌gw-2进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

本发明还提供了一种含有上述极端嗜高温菌或含有上述突变体的菌体培养物。

本发明还提供了一种菌体培养物，所述菌体培养物为菌液、菌剂或活性污泥等。

本发明还提供了一种含有上述极端嗜高温菌或上述突变体的酶制剂或单细胞蛋白。

本发明还公开了可将上述极端嗜高温菌或上述突变体应用于污水处理、垃圾处理、堆肥、酶制剂生产、单细胞蛋白生产中。

本发明还提供了一种高温堆肥发酵方法，包括以下步骤：

1）首批物料预处理。

2）菌种投放：将权利要求1或2所述极端嗜高温菌或权利要求3所述突变体发酵完成后所得发酵液与木屑充分混合，在60-85℃下烘干形成菌剂，将菌剂投放至首批物料中。

3）物料加热。

4）高温发酵：发酵温度为70-100℃。

5）半连续进料出料。

作为优选，步骤1）具体为：将首批物料切割打碎，使之成为半径3-5cm的颗粒状，然后加入占物料质量3-6%的生石灰，所得混合物控制含水率在70-85%；搅拌均匀后向每吨物料中依次投入0.3-1.0g酯酶、0.8-2.0g纤维素酶、0.3-1.0g碱性淀粉酶、0.2-1.2g碱性蛋白酶，再次混合均匀，静置0.5-1h。

本发明采用特殊的物理切割、加热、化学水解、酶法水解等预处理手段，使肥堆能够快速发热升温至60℃以上，从而快速进入堆肥的高温阶段，使得gw-2菌种快速成为肥堆体系内的绝对优势菌种，并以此为基础，实现可每日补料出料的连续堆肥发酵工艺。

在本发明预处理中，物理切割的原因是物料粒径越小越容易分解，但是，考虑到在增加物料表面积的同时，还必须保持一定程度的孔隙率，以便于通风而使物料能够获得充足的氧供应，因此此处将有机物料切割粉碎成3-5cm的碎块。物料中加入3-6%的生石灰，可以与物料中多余的水分反应放热，使物料快速升温，同时可以控制物料的含水率在70-85%的最佳反应湿度。物料中投入的酯酶、纤维素酶、碱性淀粉酶、碱性蛋白酶。则可以辅助将物料中的淀粉类、蛋白类、脂类物质提前水解为易于被高温菌种利用的小分子，从而使堆肥快速进入高温阶段。

作为优选，步骤2）中，将发酵液与木屑按体积比1:0.8-1.0进行混合，烘干制成的菌剂按首批物料质量的25-35%进行投加。

作为优选，步骤3）具体为：将首批物料加热至45℃以上，然后保持加热状态2-4h，直至堆体温度达到60-65℃，停止加热。

作为优选，步骤4）具体为：将发酵环境湿度控制在85-90%，若湿度不足则及时补水或垃圾渗沥液；发酵时间持续48-60h。

本发明菌剂在40℃温度条件下激活后，迅速繁殖并分解有机质，产生大量热量，使得物料温度升高至70-100℃，并可维持该高温直至物料完成腐殖化并将大部分水分气化。发酵完成后，物料可减重70-92%。在发酵过程中，设备控制发酵容器内空气湿度在80-90%之间，湿度不足则设备通过喷水来补水。gw-2菌可抑制有害杂菌生长，不产生恶臭、馊味等异味。

作为优选，步骤5）具体为：经过高温发酵后，物料转变为腐殖质，然后开始进入反复进料出料阶段；出料占比控制在20wt%以下，进料无需再次进行预处理而直接投加，投加量不超过步骤4）所得物料的20wt%；在反复进料出料阶段，每一次的间隔控制在12-24h。

作为优选，每一批菌剂投放后可满足30-50次出料补料操作所需，此后需根据步骤2）-5）重新开始发酵周期。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

1）本发明菌株能够在40-105℃、ph5-11、盐度0-7%（w/v）范围内正常代谢生长，可利用多种单糖、寡糖、多糖、有机酸、醇作为碳源，以及可利用胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉膏等多种复合氮源进行生长，底物谱十分宽广。

2）本发明菌株配合本发明特殊高温堆肥工艺可用于对餐厨垃圾、农产品尾料、屠宰场废料等多种有机质进行高温好氧堆肥处理，使得有机质物料完全腐殖质化、脱水干化并减重70-92%，最终形成品质优良的有机肥。

3）本发明高温堆肥工艺还涉及到特殊的物理切割、加热、化学水解、酶法水解等预处理手段，使肥堆能够快速发热升温至60℃以上，从而快速进入堆肥的高温阶段，使得gw-2菌种快速成为肥堆体系内的绝对优势菌种，并以此为基础，实现可每日补料出料的连续堆肥发酵工艺。

附图说明

图1为极端嗜高温菌gw-2在不同温度下的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种极端嗜高温菌，其命名为gw-2，已在2019年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc18012，微生物分类命名为chelativoranscomposti；所述gw-2的16s核糖体亚基基因序列如seqidno.1所示。

作为优选，所述极端嗜高温菌还可以为前述gw-2的培养物或者传代后的培养物。

一种极端嗜高温菌的突变体，所述突变体为对前述gw-2进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

一种含有上述极端嗜高温菌或含有上述突变体的菌体培养物。

一种菌体培养物，所述菌体培养物为菌液、菌剂或活性污泥等。

一种含有上述极端嗜高温菌或上述突变体的酶制剂或单细胞蛋白。

本发明还公开了可将上述极端嗜高温菌或上述突变体应用于污水处理、垃圾处理、堆肥、酶制剂生产、单细胞蛋白生产中。

图1为本菌株gw-2在不同温度（70℃，80℃，90℃，100℃）下的生长曲线。由图可以看出，gw-2在70℃，80℃，90℃时，菌活性随温度升高而降低，而在100℃时，又有所下降。故gw-2最适温度在90℃附近。且60℃-100℃范围内，菌株活性虽然有所波动，但整体仍然在一个较高的水平。

一种高温堆肥发酵方法，包括以下步骤：

1）首批物料预处理：将作为首批物料的原始有机垃圾物料切割粉碎成直径为3-5cm的碎块，与其质量3-6%的生石灰混合，所得混合物控制含水率在70-85%；并按每吨原始有机垃圾物料中投入0.3-1.0g酯酶、0.8-2.0g纤维素酶、0.3-1.0g碱性淀粉酶、0.2-1.2g碱性蛋白酶，充分混合，静置0.5-1h。

2）菌种投放：将前述极端嗜高温菌或前述突变体发酵完成后所得发酵液与木屑充分混合，在55-65℃下烘干形成菌剂，将菌剂投放至首批物料中。其中，所述发酵液与木屑的体积比为1:0.8-1.0；所述菌剂的添加量至少为首批物料重量的30%。

3）物料加热：首批物料以及菌种投放至带有电加热、搅拌、通气、和补水功能的发酵装置中，采用电加热的方式使物料在1小时内升温至45℃以上，并维持加热2-4小时，待物料温度上升至60-65℃后，停止电加热。

4）高温发酵：发酵温度为70-100℃，发酵环境空气湿度控制在80-90%，若湿度不足则进行补水或垃圾渗沥液；高温发酵时间为48-60h。

5）半连续进料出料：经过步骤4）的高温发酵后完成腐殖化，开始出料进料；出料比例不超过20%，而后投入新的有机质垃圾物料，新料投入无需再进行预处理，也无需控制水分比例，可以直接投放，投放的比例不得超过肥堆原始重量的20%。新料补充后18-24h内即可进行第二次出料补料，反复操作即可实现半连续发酵。其中，每一批菌剂投放后可满足30-50次出料补料操作所需，此后需根据步骤2）-5）重新开始发酵周期。

实施例1：餐厨垃圾堆肥处理

取5吨餐厨垃圾，切割搅拌使之变成大约直径3cm的碎块。将碎块投入发酵装置中，并加入3%生石灰，0.5g酯酶、0.8g纤维素酶、0.4g碱性淀粉酶、0.5g碱性蛋白酶，将物料含水率控制在80%左右，搅拌均匀后静止0.5h。然后往发酵罐内投入1.5吨gw-2菌剂（制作时，发酵液与干木屑的体积比例为1:0.9），搅拌均匀后启动加热，经过0.5h，发酵罐内温度达到45℃。维持加热3h后，温度上升至60℃，停止加热，此时进入高温堆肥阶段。20h后，温度上升至100℃，湿度降为75%。24h后发酵罐内温度开始缓慢降低，44h后降至60℃，此时取出20wt%发酵后物料，重新投入1吨未做预处理的餐厨垃圾。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料45h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料1.8吨，含水率35.8%，物料减重88.1%。

实施例2：养殖固废堆肥

取10吨养猪场粪便，投入4.5%生石灰，搅拌均匀，物料的含水率控制在82%，投入0.8g酯酶、1.3g纤维素酶、0.3g碱性淀粉酶、0.8g碱性蛋白酶继续混合搅拌，开启电加热升温至45℃并维持1h。投入4吨gw-2菌剂木屑，（制作时，发酵液与干木屑的体积比例为1：0.8）充分搅拌，加大电加热功率升温至45℃，启动高温堆肥。启动4h后，肥堆温度升至65℃，并在启动24小时内逐步升高温度，最后达到85-100℃，湿度由初始的80%左右逐步降低，最后约为53%。随后温度缓慢下降，在启动48小时内温度回落至65℃，此时排出20%体积的老料，补充2吨新料继续发酵。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料24h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料4.2吨，含水率37.5%，物料减重86.0%。

实施例3：农副产品肥料堆肥

取5吨秸秆，加入带切割搅拌的发酵装置进行连续切割搅拌为6cm左右的碎片，投入5%生石灰，搅拌均匀，物料的含水率控制在85%，投入0.7g酯酶、1.3g纤维素酶、0.6g碱性淀粉酶、0.5g碱性蛋白酶继续混合搅拌，开启电加热升温至45℃并维持2h。投入2.5吨gw-2菌剂木屑，（制作时，发酵液与干木屑的体积比例为1:1）充分搅拌，加大电加热功率升温至45℃，启动高温堆肥。启动4h后，肥堆温度升至60℃，并在启动24小时内逐步升高温度，最后达到85-100℃，湿度由初始的87%逐步降低，最后约为58%。随后温度缓慢下降，在启动60小时内温度回落至65℃，此时排出25%体积的老料，补充1.25吨新料继续发酵。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料24h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料2.36吨，含水率35%，物料减重81.1%。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>杭州秀川科技有限公司

<120>一种极端嗜高温菌及其在高温堆肥发酵中的应用

<130>2019

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1348

<212>dna

<213>极端嗜高温菌gw-2(chelativoranscompostigw-2)

<400>1

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