检测Ⅲ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法与流程

本发明属于单核苷酸多态性检测技术领域，具体涉及一种检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法。

背景技术：

ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗株—sabinⅲ株是将脊髓灰质炎病毒leon3株通过不断传代和筛选纯化，选育出的免疫原性好，神经毒力低的病毒株。因为sabinⅲ株是活病毒，所以口服后会引起隐性感染，刺激人体在粘膜免疫和体液免疫的过程中产生保护性抗体。这些保护性抗体会在人体遇到野生病毒攻击时，对人体提供保护。此外，脊灰减毒疫苗株在人体内经过繁殖后会以活病毒形式通过肠道排出体外。不致病的减毒活疫苗病毒在环境中存活，可以刺激周围人群产生保护性抗体，从而形成保护屏障，阻断脊灰病毒在自然界的传播。减毒疫苗株是活病毒，在繁殖的过程中有可能产生突变，其中有很少部分会有恢复野毒毒性的倾向，其非编码区472位点核酸发生回复突变，可能导致毒力升高，并使接种疫苗的儿童发生疫苗相关麻痹性脊灰(vapp)。因此，在脊髓灰质炎减毒活疫苗生产和使用的过程中，通过监控脊灰病毒毒力突变情况，对脊灰减毒疫苗株及其衍生物的基因稳定性进行检测，是疫苗安全性评价的重要指标。

疫苗毒力检测的经典方法为猴体神经毒力试验，后来又建立了转基因小鼠模型。这两种方法可以通过动物体征的改变对脊灰病毒的神经毒性进行直接观察和评估。但这两种方法分别存在需要使用特殊的动物，费用高昂、耗时很长，试验步骤繁琐、结果判断存在一定主观性等问题。随着分子生物学技术的发展，发现了ⅲ型脊髓灰质炎病毒的减毒性状相关的一些突变位点。对于这些位点的碱基突变进行检测，可以对疫苗的毒力等遗传稳定性进行评估。而现有技术中将聚合酶链反应和限制性酶切相结合，产生了maprec技术，即通过pcr引入非突变病毒上没有的限制性内切酶酶切位点，通过酶切后电泳分离的方法，鉴别突变病毒和未突变病毒。但是maprec试验需要放射性核素标记，对实验设施设备的要求较高，过程复杂。此外，用于基因突变的研究方法还有定量荧光pcr和基因测序等方法，但是都存在局限性，例如：定量荧光pcr是在pcr反应体系中加入荧光标记的特异性引物和探针，通过对探针荧光信号变化情况的实时监测，来分析样品中的基因突变情况，该方法对突变的检测通常只能是相对定量，在同一孔中同时检测多个突变位点时，需要使用不同的荧光通道；又如测序法包括waltergilbert化学法和sanger双脱氧链终止法。现在主要使用的是sanger测序法，该方法步骤繁琐，试验周期长(一般需2-3天)，对操作人员技术水平要求高，更为重要的是，测序技术本身灵敏度不高，通常只能检测15％以上的突变。而sabinⅲ疫苗株非编码区472位点核酸突变往往是一种混合物，即在同一位点既有减毒核苷酸碱基，也出现少量返祖基因碱基。这时测序方法对于固定靶点出现的低频率突变分辨十分困难，存在较大的不确定性，往往需要非常大的样本量和反复检测来进行分析。

基于现有技术中检测基因突变方法存在各种缺陷，本申请采用质谱检测法，建立脊灰减毒疫苗毒力相关位点突变的检测方法，具有准确、非放射性、非动物体内、直接定量的优点，一方面可以减少猴体等动物的使用，另一方面可以减少放射性物质的使用；此外由于可以对突变率进行准确定量判断，比测序方法更能全面了解突变情况。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的目的是提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测引物组。

本发明的目的是提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法，通过将pcr技术和质谱检测技术结合，可以特异、准确的测定ⅲ型脊灰减毒活疫苗特定位点核酸突变情况，为判断脊灰疫苗株毒力情况提供重要的数据支持。

本发明还有一个目的是提供一种质谱检测引物组及质谱检测方法在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测引物组，所述引物组包括如下引物：

特异性上游引物s32：5’-gagcctattgagctacatgagagtcct-3’；

特异性下游引物a3：5’-gctcccattgtgacactgaaatcctg-3’；

通用性上游引物s2-2：5’-aatcctccggcccctgaatg-3’；

通用性下游引物a2y：

5’-gtcaccataagcagccacaataaaataaaag-3’；

延伸引物py3-p1：5’-cctgaatgcggctaat-3’；

延伸引物py3-p2：5’-ctgcctgctccatggttag-3’。

优选的是，所述引物组还包括与所述引物同源性为90％以上的核苷酸序列。

本发明还提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1：从检测样品中获得脊髓灰质炎病毒，并提取rna；

步骤2：采用权利要求1中所述的特异性上游引物s32、特异性下游引物a3、通用性上游引物s2-2及通用性下游引物a2y，利用模板rna逆转录成cdna，再以cdna为模板，采用一步法或两步法进行rt-pcr扩增，得到含有ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点的片段；

步骤3：对步骤2所得的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

步骤4：利用权利要求1所述的延伸引物py3-p1或延伸引物py3-p2对步骤3所得的脱磷酸片段进行单碱基延伸反应；

步骤5：对步骤4延伸后的样品进行脱盐纯化处理；

步骤6：脱盐处理后，用核酸质谱仪检测分析目标基因特定位点的基因序列。

优选的是，一步法rt-pcr采用25μl扩增反应体系，其包括以下组分：2×buffer12.5μl、酶1.0μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、模板rna1.0μl、depc水4.5μl；

一步法扩增程序：50℃30min；95℃5min；95℃30s，56-72℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

优选的是，两步法rt-pcr中逆转录采用50μl反应体系，其包括以下组分：dntp1.0μl、depc水28.0μl、下游引物(a2y或a3)1.0μl、5×buffer10.0μl、dtt2.0μl、rna抑制剂1.0μl、模板rna5.0μl、mlv2.0μl；

逆转录反应程序：37℃50min；95℃5min；

pcr扩增反应体系，包括以下组分：dna聚合酶2×buffer12.5μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、cdna5.0μl、depc水1.5μl；

pcr扩增程序：95℃30s，56-72℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

优选的是，步骤3中的去磷酸化采用2μl反应体系，包括如下组分：高压灭菌纯化水1.53μl、磷酸消化酶缓冲液0.17μl、磷酸消化酶0.30μl；

去磷酸化反应条件：37℃40min，85℃5min；12℃恒温。

优选的是，步骤4中单碱基延伸采用2μl反应体系，包括如下组分：高压灭菌纯化水0.169μl、延伸缓冲液0.200μl、延伸引物混合液0.940μl、测序酶0.041μl；

反应条件：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min；12℃恒温。

优选的是，步骤6中所述特定位点为ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点。

本发明还提供一种所述的质谱检测引物组在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

本发明还提供一种所述的质谱检测方法在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过从脊灰疫苗相关样品中提取rna，利用针对ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变设计的特异性引物和通用性引物，经rt-pcr扩增得到含有snp位点的基因片段，再通过磷酸消化酶对扩增产物去磷酸化，防止dna分子5’端和3’端连接，之后经延伸引物对单碱基进行延伸后，用质谱检测法检测突变位点碱基突变类型，以判断ⅲ型脊灰减毒活疫苗是否发生突变。本发明相比现有技术中的猴体神经毒力试验、转基因小鼠模型、maprec试验、定量荧光法以及测序法，具有简单易操作、准确、非放射性、非动物体内、直接定量检测等优点，一方面可以减少猴体等动物的使用，另一方面可以减少放射性物质的使用；此外，由于可以对突变率进行准确定量，比测序方法更能全面了解突变情况。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为经延伸引物py3-p1延伸的未突变产物质谱检测结果；

图2为经延伸引物py3-p2延伸的未突变产物质谱检测结果；

图3为经延伸引物py3-p1延伸的回复突变产物质谱检测结果；

图4为经延伸引物py3-p2延伸的回复突变产物质谱检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测引物组，所述引物组包括如下引物：

特异性上游引物s32：5’-gagcctattgagctacatgagagtcct-3’；

特异性下游引物a3：5’-gctcccattgtgacactgaaatcctg-3’；

通用性上游引物s2-2：5’-aatcctccggcccctgaatg-3’；

通用性下游引物a2y：

5’-gtcaccataagcagccacaataaaataaaag-3’；

延伸引物py3-p1：5’-cctgaatgcggctaat-3’；

延伸引物py3-p2：5’-ctgcctgctccatggttag-3’。

在上述方案中，所述引物组是基于ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸进行设计的，由于现有技术中sabinⅲ株主要是通过口服形式使用，而sabinⅲ株是活病毒，口服后刺激人体在粘膜免疫和体液免疫的过程中产生保护性抗体，可以在人体遇到野病毒攻击时，对人体进行保护。而在脊灰减毒疫苗株在人体内经过繁殖后，会以活病毒形式通过肠道排出体外，其在繁殖的过程中有可能产生突变，其中有很少部分会有恢复野毒毒性的倾向，而非编码区472位点核酸发生回复突变，可能导致毒力升高，并使接种疫苗的儿童发生疫苗相关麻痹性脊灰(vapp)，因此，特异性针对突变几率最高非编码区472位点核酸设计引物，对于判断ⅲ型脊灰减毒活疫苗的毒力具有重要意义。

一个优选方案中，所述引物组还包括与所述引物同源性为90％以上的核苷酸序列。

在上述方案中，经大量实验证明，利用与上述引物同源性90％以上的核苷酸序列，同样能实现对ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测。

本发明提供一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1：从检测样品中获得脊髓灰质炎病毒，并提取rna；

步骤2：采用权利要求1中所述的特异性上游引物s32、特异性下游引物a3、通用性上游引物s2-2及通用性下游引物a2y，利用模板rna逆转录成cdna，再以cdna为模板，采用一步法或两步法进行rt-pcr扩增，得到含有ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点的片段；

步骤3：对步骤2所得的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

步骤4：利用权利要求1所述的延伸引物py3-p1或延伸引物py3-p2对步骤3所得的脱磷酸片段进行单碱基延伸反应；

步骤5：对步骤4延伸后的样品进行脱盐纯化处理；

步骤6：脱盐处理后，用核酸质谱仪检测分析目标基因特定位点的基因序列。

在上述方案中，基于rt-pcr技术，首先通过pcr引物对含待检测snp的目标片段进行扩增，pcr结束后通过磷酸消化酶对扩增产物去磷酸化，防止dna分子的5’端和3’端连接，再通过延伸引物对单碱基进行延伸，根据不同snp延伸模板可得到不同的延伸产物，然后经过脱盐纯化后，利用核酸质谱检测方法进行检测，基于核酸质谱检测的原理，利用核酸质谱检测方法仅在目的区域snp位点延伸一个具有多态性的碱基，不需要检测整个特异性扩增的基因片段，可以大大缩短检测时间、成本，还能直接定量检测，相比现有检测手段可大大提高检测率。

一个优选方案中，一步法rt-pcr采用25μl扩增反应体系，其包括以下组分：2×buffer12.5μl、酶1.0μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、模板rna1.0μl、depc水4.5μl；

一步法扩增程序：50℃30min；95℃5min；95℃30s，56-72℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

一个优选方案中，两步法rt-pcr中逆转录采用50μl反应体系，其包括以下组分：dntp1.0μl、depc水28.0μl、下游引物(a2y或a3)1.0μl、5×buffer10.0μl、dtt2.0μl、rna抑制剂1.0μl、模板rna5.0μl、mlv2.0μl；

逆转录反应程序：37℃50min；95℃5min；

pcr扩增反应体系，包括以下组分：dna聚合酶2×buffer12.5μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、cdna5.0μl、depc水1.5μl；

pcr扩增程序：95℃30s，56-72℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

一个优选方案中，步骤3中的去磷酸化采用2μl反应体系，包括如下组分：高压灭菌纯化水1.53μl、磷酸消化酶缓冲液0.17μl、磷酸消化酶0.30μl；

去磷酸化反应条件：37℃40min，85℃5min；12℃恒温。

一个优选方案中，步骤4中单碱基延伸采用2μl反应体系，包括如下组分：高压灭菌纯化水0.169μl、延伸缓冲液0.200μl、延伸引物混合液0.940μl、测序酶0.041μl；

反应条件：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min；12℃恒温。

一个优选方案中，步骤6中所述特定位点为ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点。

本发明还提供一种所述的质谱检测引物组在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

本发明还提供一种所述的质谱检测方法在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

在上述方案中，采用质谱检测引物组，利用rt-pcr和质谱检测方法相结合，可以改变现有技术中进行ⅲ型脊灰减毒活疫苗基因突变检测费用高昂、耗时很长，试验步骤繁琐、结果判断存在一定主观性等问题，对于准确判断ⅲ型脊灰减毒活疫苗毒力提供技术支持。

为了更好的说明本方案的实施方法，通过以下实施例进行进一步说明。

实施例1

ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法

1、rna提取

利用rna提取试剂盒(invitrogen^tm试剂盒)从口服脊髓灰质病毒疫苗(萨宾)株或疫苗衍生物中获取脊髓灰质炎病毒(ⅲ型脊灰病毒)rna。

2、引物设计

针对ⅲ型脊灰病毒非编码区472位点核酸进行snp位点引物设计，所设计的引物包括特异性上游引物s32、特异性下游引物a3、通用性上游引物s2-2、通用性下游引物a2y、延伸引物py3-p1、延伸引物py3-p2，具体如下表1所示：

表1引物

3、逆转录和rt-pcr扩增反应

利用模板rna逆转录成cdna，再以cdna为模板进行pcr扩增，得到含有ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点的片段，可以通过一步法或两步法完成，以下分别对一步法和两步法的条件进行了具体的说明。

3.1一步法rt-pcr

rt-pcr反应体系如表2所示：

表2一步法rt-pcr反应体系

一步法rt-pcr反应条件如表3所示：

表3rt-pcr扩增的反应条件

3.2两步法rt-pcr

(1)逆转录反应体系如表4所示：

表4逆转录反应体系

表5逆转录反应条件

(2)两步法pcr扩增反应体系如表6所示：

表6pcr扩增的反应体系

rt-pcr扩增的反应条件如表7所示：

表7rt-pcr扩增的反应条件

4、去磷酸化反应

对扩增的目的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段。

去磷酸化反应体系如表8所示：

表8去磷酸化反应体系

去磷酸化反应条件如表9所示：

表9去磷酸化反应条件

5、单碱基延伸反应

利用延伸引物py3-p1或延伸引物py3-p2对所得脱磷酸片段进行单碱基延伸反应。

(1)延伸引物配制(稀释成500p)如表10所示：

表10延伸引物配制

(2)延伸引物反应体系如表11所示：

表11延伸引物反应体系

(3)延伸引物反应条件如表12所示：

表12延伸引物反应条件

6、延伸后的产物进行脱盐纯化处理，具体为：

s1：在树脂板上均匀填充树脂，45℃恒温风干4-5min；

s2：向样本板的反应孔中加入待测样品，每孔补充15μl超纯水，用封口膜密封，于2000-2500rpm瞬时离心；

s3：打开封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，以使树脂板中的树脂完全落入样本板的样本孔中，用封口膜密封，于2000-2500rpm瞬时离心；

s4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转30min后，于5000rpm高速离心5-10min，然后点样上机进行质谱检测，并通过核酸质谱仪上机及软件数据进行分析。

按照上机操作规程进行检测，待样品检测完毕，对检测结果进行软件处理分析，最终得到检测结果。

实施例2鉴定单个核苷酸多态性试验

利用实施例1的质谱检测方法分别对以下样品核酸进行检测，结果如图1-图4所示。

从图1可以看出，样品核酸的扩增产物经py3-p1延伸后，脊髓灰质炎疫苗(sabin株)或疫苗衍生物样品核酸质谱在472(分子量为5208.26)位置出现明显峰值t，没有其他碱基(a、c、g对应分子量)峰出现，说明是样品中该基因位点均为t碱基。

从图2可以看出，脊髓灰质炎疫苗(sabin株)或疫苗衍生物样品核酸的扩增产物经py3-p2延伸后，样品核酸质谱在472(分子量为4830.13)位置出现明显峰值t，没有其他碱基(a、c、g对应分子量)峰出现，说明是样品中该基因位点均为t碱基。

从图3可以看出，样品核酸的扩增产物经py3-p1延伸后，脊灰病毒野毒株样品核酸质谱在472(分子量为5128.36)位置出现明显峰值c，没有其他碱基(a、t、g对应分子量)峰出现，说明是样品中该基因位点均为野毒株c碱基。

从图4可以看出，样品核酸的扩增产物经py3-p2延伸后，脊灰病毒野毒株样品核酸质谱在472(分子量为4846.13)位置出现明显峰值c，没有其他碱基(a、t、g对应分子量)峰出现，说明是样品中该基因位点均为野毒株c碱基。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中囯食品药品检定研究院

<120>检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagcctattgagctacatgagagtcct27

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gctcccattgtgacactgaaatcctg26

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatcctccggcccctgaatg20

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtcaccataagcagccacaataaaataaaag31

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgaatgcggctaat16

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctgcctgctccatggttag19