检测Ⅲ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法与流程

文档序号:20200799发布日期:2020-03-27 20:37阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测引物组,其特征在于,所述引物组包括如下引物:

特异性上游引物s32:5’-gagcctattgagctacatgagagtcct-3’;

特异性下游引物a3:5’-gctcccattgtgacactgaaatcctg-3’;

通用性上游引物s2-2:5’-aatcctccggcccctgaatg-3’;

通用性下游引物a2y:

5’-gtcaccataagcagccacaataaaataaaag-3’;

延伸引物py3-p1:5’-cctgaatgcggctaat-3’;

延伸引物py3-p2:5’-ctgcctgctccatggttag-3’。

2.如权利要求1所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测引物组,其特征在于,所述引物组还包括与所述引物同源性为90%以上的核苷酸序列。

3.一种ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1:从检测样品中获得脊髓灰质炎病毒,并提取rna;

步骤2:采用权利要求1中所述的特异性上游引物s32、特异性下游引物a3、通用性上游引物s2-2及通用性下游引物a2y,利用模板rna逆转录成cdna,再以cdna为模板,采用一步法或两步法进行rt-pcr扩增,得到含有ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点的片段;

步骤3:对步骤2所得的片段进行去磷酸化处理,得到脱磷酸片段;

步骤4:利用权利要求1所述的延伸引物py3-p1或延伸引物py3-p2对步骤3所得的脱磷酸片段进行单碱基延伸反应;

步骤5:对步骤4延伸后的样品进行脱盐纯化处理;

步骤6:脱盐处理后,用核酸质谱仪检测分析目标基因特定位点的基因序列。

4.如权利要求3所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,一步法rt-pcr采用25μl扩增反应体系,其包括以下组分:2×buffer12.5μl、酶1.0μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、模板rna1.0μl、depc水4.5μl;

一步法扩增程序:50℃30min;95℃5min;95℃30s,56-72℃10s,72℃10-20s,25-40个循环;72℃1min;4℃恒温。

5.如权利要求3所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,两步法rt-pcr中逆转录采用50μl反应体系,其包括以下组分:dntp1.0μl、depc水28.0μl、下游引物(a2y或a3)1.0μl、5×buffer10.0μl、dtt2.0μl、rna抑制剂1.0μl、模板rna5.0μl、mlv2.0μl;

逆转录反应程序:37℃50min;95℃5min;

pcr扩增反应体系,包括以下组分:dna聚合酶2×buffer12.5μl、上游引物(s32或s2-2)3.0μl、下游引物(a3或a2y)3.0μl、cdna5.0μl、depc水1.5μl;

pcr扩增程序:95℃30s,56-72℃10s,72℃10-20s,25-40个循环;72℃1min;4℃恒温。

6.如权利要求3所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,步骤3中的去磷酸化采用2μl反应体系,包括如下组分:高压灭菌纯化水1.53μl、磷酸消化酶缓冲液0.17μl、磷酸消化酶0.30μl;

去磷酸化反应条件:37℃40min,85℃5min;12℃恒温。

7.如权利要求3所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,步骤4中单碱基延伸采用2μl反应体系,包括如下组分:高压灭菌纯化水0.169μl、延伸缓冲液0.200μl、延伸引物混合液0.940μl、测序酶0.041μl;

反应条件:95℃30s;[95℃5s,(52℃5s,80℃5s)5个循环]40个循环;72℃3min;12℃恒温。

8.如权利要求3所述的ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸质谱检测方法,其特征在于,步骤6中所述特定位点为ⅲ型脊灰减毒非编码区472位点。

9.一种如权利要求1和2任一项所述的质谱检测引物组在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

10.一种如权利要求3-8任一项所述的质谱检测方法在检测ⅲ型脊灰减毒活疫苗非编码区472位点核酸突变中的应用。

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