调控玉米光合特性主效QTL的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种调控玉米净光合速率、气孔导度和水分利用效率等光合特性主效qtl的分子标记及其应用。

背景技术：

作物95％左右的碳水化合物积累均来自于自身的光合作用，光合作用的强弱及效率的高低直接关乎作物的产量，因此提高作物的光合特性，改善高密度种植条件下群体冠层对光能的吸收与利用，从而进一步提高作物的增产潜力一直是高光效育种研究领域的热点。此外，国内外学者研究还发现作物的光合作用与其抗旱性紧密相关，干旱缺水时玉米(zeamaysl.)、水稻(oryzasatival.)、小麦(triticumaestivuml.)等粮食作物的psi(photosytemi)和psii(photosytemii)均遭到破坏，rubisco羧化酶(ribulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase,rubisco)、rubpcase酶(ribulose1,5-biphosphatecarboxylaseactivity,rubp)等一系列光合作用相关的酶受到抑制，叶绿素降解、导致这些作物的净光合速率(netphotosyntheticrate,pn)显著减弱、气孔导度(stomatalconductance,gs)和蒸腾速率(transpirationrate,tr)降低、降低胞间co2浓度(intercellularco2concentration,ci)和水分利用效率(wateruseefficiency,wue)增加，作物最终严重减产。

玉米作为重要的c4粮食作物，在保障国家粮食安全、促进畜牧业及工业发展等方面扮演着重要角色。然而玉米对干旱较为敏感，且我国三分之二的玉米主要分布于依靠自然降水的东北、西北及西南等旱作区，一般干旱可使我国玉米减产20～50％。因此，深入揭示玉米复杂的光合特性遗传机制，挖掘调控玉米光合特性重要的基因/qtl(quantitativetraitlocus)，进而用于玉米高光效分子标记辅助选择育种(marker-assistedselection,mas)或转基因育种中，最终缩短玉米育种进程，加速优良玉米品种的更新换代及推广。目前，玉米光合特性(pn、gs、ci、tr、rubp、wue等)qtl定位研究已成为学者和育种家关注的热点课题，但具有育种应用价值的光合特性qtl位点较少。因此，挖掘不同环境及遗传背景下稳定表达的光合特性主效qtl对玉米高光效抗旱育种具有巨大的潜在应用价值。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种调控玉米净光合速率、气孔导度和水分利用效率等光合特性主效qtl的分子标记，本发明还提供辅助选择高光效利用、气孔导度相对较大且抗旱、高水分利用效率的玉米材料方法，本发明还提供调控玉米净光合速率、气孔导度和水分利用效率等光合特性主效qtl的分子标记在玉米高光效、抗旱及高产育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1、一种调控玉米净光合速率、气孔导度和水分利用效率等光合特性主效qtl的分子标记，其特征在于：分别由umc1177和umc2012两对、umc1395和umc1356两对及mmc0041、phi308707和umc1847四对ssr分子标记引物组成；

如序列表seqidno：1和seqidno：2所示，所述ssr分子标记引物umc1177的序列为：

forward:5’-cgtgtaccgctcctctatagtcgt-3’

reverse:5’-aagtggccgaattcatcctttatt-3’

如序列表seqidno：3和seqidno：4所示，所述ssr分子标记引物umc2012的序列为：

forward:5’-cttgcattgaacgacgacctg-3’

reverse:5’-cgtacgcttgcaatgcttctct-3’

如序列表seqidno：5和seqidno：6所示，所述ssr分子标记引物umc1395的序列为：

forward:5’-tgaatgagtggcattcaaaatctg-3’

reverse:5’-cagattgcatgtgtgagtgtgtgt-3’

如序列表seqidno：7和seqidno：8所示，所述ssr分子标记引物umc1356的序列为：

forward:5’-atacatttttacgtccacgccg-3’

reverse:5’-ctaggatagtaggagtgcagggca-3’

如序列表seqidno：9和seqidno：10所示，所述ssr分子标记引物bnlg1025的序列为：

forward:5’-tggtgaaggggaagatgaag-3’；

reverse:5’-ccgagacgtgactcctaagc-3’；

如序列表seqidno：11和seqidno：12所示，所述ssr分子标记引物mmc0041的序列为：

forward:5’-aggacttagagaggaaacgaa-3’；

reverse:5’-tttatccttacttgcagttgc-3’；

如序列表seqidno：13和seqidno：14所示，所述ssr分子标记引物phi308707的序列为：

forward:5’-gcaacaagatccagccgat-3’；

reverse:5’-gtcgccctcatatgaccttc-3’；

如序列表seqidno：15和seqidno：16所示，所述ssr分子标记引物umc1847的序列为：

forward:5’-gcccaaggtagatttttactctcca-3’；

reverse:5’-aagtcgtagagctcgtcgtgatg-3’。

2、一种辅助选择高光效利用、气孔导度相对较大且抗旱、高水分利用效率玉米材料的方法，步骤如下：提取待测玉米的基因组dna；用分子标记引物umc1177和umc2012、umc1395和umc1356及bnlg1025、mmc0041、phi308707和umc1847进行pcr扩增；当得到长度为96bp和149bp、203bp和148bp及194bp、146bp、121bp和153bp的扩增产物，则待测玉米为高光效利用(强净光合速率)、气孔导度相对较大且抗旱、高水分利用效率的玉米。

3、调控玉米净光合速率、气孔导度及水分利用效率等光合特性主效qtl的分子标记在玉米育种中的应用，其特征在于：用本发明提供的辅助选择强净光合速率、气孔导度相对较大且抗旱、高水分利用效率玉米的方法鉴定出候选高光效利用、气孔导度相对较大且抗旱、高水分利用效率的玉米材料，再将候选的玉米材料应用于玉米育种中。

本发明的有益效果在于：本发明以一个共同父本ts141与两个母本昌7-2与廊黄分别杂交构建的2套分别含218和202个株系的f4群体(pop-ct和pop-lt)为试材，在正常供水(well-wateredenvironment,ww)和干旱胁迫(drought-stressedenvironment,ds)等2种水分环境下，采用复合区间作图法(compositeintervalmapping,cim)和基于混合线性模型的复合区间作图法(mixed-linear-model-basedcompositeintervalmapping,mcim)对2套f4群体进行了qtl分析，最终在玉米第一染色体bin1.01区域的umc1177和umc2012分子标记间存在一个调控玉米净光合速率(pn)的主效qtl，发明人将该主效qtl命名为qpn-ch.1-1。采用cim在pop-ct群体的ww和ds两种水分环境下，该qpn-ch.1-1在pop-ct群体中的表型贡献率分别为10.65％和15.02％。分析表明利用这两对ssr分子标记对待测玉米材料进行pcr扩增，可以对待测玉米的净光合作用强弱进行预测；在玉米第一染色体bin1.05_1.07区域的umc1395-umc1356分子标记间存在一个调控玉米气孔导度的主效qtl，发明人将该主效qtl命名为qgs-ch.1-1。采用cim和mcim等定位方法在pop-lt群体间该主效qgs-ch.1-1均能稳定表达，且该主效qgs-ch.1-1的累计表型贡献率为19.86％。分析表明利用这两对ssr分子标记对待测玉米材料进行pcr扩增，可以对待测玉米叶片气孔导度的大小进行预测；在玉米第一染色体bin1.07_1.10区域的bnlg1025-mmc0041-phi308707-umc1847分子标记间存在一个调控玉米水分利用效率的主效qtl，发明人将该主效qtl命名为qwue1。采用cim和mcim等定位方法在2套群体间该主效qwue1均能稳定表达，且qwue1的累计表型贡献率为24.97％。分析表明利用这四对ssr分子标记对待测玉米材料进行pcr扩增，可以对待测玉米水分利用效率的高低进行预测。

通过本发明公布的ssr分子标记进行分子标记辅助选择，只需检测相应ssr分子标记的特征扩增条带，即可预测玉米净光合速率、气孔导度及水分利用效率等光合特性的大小，此鉴定方法易于操作、简单可行、选择效率高。可快速鉴定出强净光合速率、气孔导度相对较大、高水分利用效率且抗旱的玉米单株，淘汰其它单株，选择目标明确，且不受环境影响，有效提高候选玉米的育种利用价值。

附图说明

图1正常供水和干旱胁迫环境处理下玉米自交系昌7-2、廊黄、ts141的上/下表皮气孔形态图；

其中a为绒毛，b为叶脉，c为气孔；

图2正常供水和干旱胁迫环境处理下玉米自交系昌7-2、廊黄、ts141的上/下表皮气孔个数、气孔长度及气孔宽度分析图；

图3正常供水和干旱胁迫环境处理下玉米自交系昌7-2、廊黄、ts141的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量及叶绿素a/b分析图；

图4正常供水和干旱胁迫环境处理下玉米自交系昌7-2、廊黄、ts141的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、叶片温度、蒸腾速率及rubpcase酶分析图；

图52019年种植pop-ct群体、pop-lt群体及亲本昌7-2、廊黄、ts141等材料田间种植的试验地气象数据统计图；

图6正常供水(ww)和干旱胁迫(ds)环境处理下pop-lt群体(a、c、e、g、i、k)、pop-ct群体(b、d、f、h、j、l)、及亲本廊黄(lh)、昌7-2(ch)、ts141(ts)的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶和水分利用效率的频率分布直方图；

图7正常供水(ww)和干旱胁迫(ds)环境处理下pop-ct群体的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶及水分利用效率的pca主成分分析图；

其中(a/b)为ww/ds环境下pop-ct群体的主成分特征值；(c/d)为ww/ds环境下pop-ct群体的主成分1(pc1)、主成分2(pc2)和主成分3(pc3)；(e/f)为ww/ds环境下pop-ct群体的主成分特征向量；

图8正常供水(ww)和干旱胁迫(ds)环境处理下pop-lt群体的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶及水分利用效率的pca主成分分析；

其中(a/b)为ww/ds环境下pop-lt群体的主成分特征值；(c/d)为ww/ds环境下pop-lt群体的主成分1(pc1)和主成分2(pc2)；(e/f)为ww/ds环境下pop-lt群体的主成分特征向量；

图9利用昌7-2与ts141杂交构建的f2分离作图群体遗传图谱图；

图10利用廊黄与ts141杂交构建的f2分离作图群体遗传图谱图；

图11采用复合区间作图法(cim)定位到的调控玉米净光合速率主效qtl(qpn-ch.1-1)位点在pop-ct群体相应染色体上的分布图；

图12采用复合区间作图法(cim)和基于混合线性模型的复合区间作图法(mcim)定位到的调控玉米气孔导度主效qtl(qgs-ch.1-1)位点在pop-lt群体相应染色体上的分布图；

图13采用复合区间作图法(cim)和基于混合线性模型的复合区间作图法(mcim)定位到的调控玉米水分利用效率主效qtl(qwue1)位点在pop-ct群体相应染色体上的分布图；

图14采用复合区间作图法(cim)和基于混合线性模型的复合区间作图法(mcim)定位到的调控玉米水分利用效率主效qtl(qwue1)位点在pop-lt群体相应染色体上的分布图。

具体实施方法

为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本发明提供一种不同水分环境下玉米穗位叶气孔形态观察、叶绿素含量及光合特性测定的方法，具体详细步骤如下：

1.材料收集：以本课题组前期筛选获得的强抗旱玉米自交系昌7-2、廊黄和旱敏感自交系ts141为试材，其中昌7-2和廊黄属于唐四平头类群(tspt)种质，ts141为瑞德(reid)类群种质。这3份玉米自交系种子均由甘肃省干旱生境作物学重点实验室分子标记辅助选育实验室提供。

2.材料田间种植、管理及试验处理：采用遮雨棚于2018年在甘肃农业大学校内试验田(36.08°n,103.70°e,1525m)进行。试验地为沙壤土，中等肥力，前茬种植玉米，播前施尿素80kg·hm^-2。采用裂区试验设计，试验地划分为正常供水区和干旱胁迫区等2个一级小区，再将每个一级小区又细分为3个二级小区随机排列步骤1的昌7-2、廊黄和ts141等3份自交系的种子，每个二级小区3.0m²(1.5m×2m)，并于4月26日播种，行距50cm，株距20cm，每行10株。干旱胁迫环境处理在玉米开花前10d开始停止灌水，18d后恢复灌水；正常供水环境处理每隔7～10d灌水一次，直到玉米生理成熟。

3.玉米穗位叶气孔形态观察：步骤2处理下的3份玉米自交系，待3份玉米自交系干旱胁迫处理14d后取3株长势整齐一致的上述3份玉米自交系植株穗位叶，采用叶片表面压印法，在晴天上午9点，制作每一处理下3份玉米自交系穗位叶距离叶脉及叶片边缘中间相同、相对部位的上/下表皮切片(叶片大小为1.0cm×1.0cm)，再将切片置于10×10倍的leicactr6000倒置荧光显微镜观察玉米穗位叶上/下表皮气孔个数，利用moticimagesadvanced3.2软件测量上/下表皮气孔长度和上/下表皮气孔宽度等形态性状。

4.玉米穗位叶叶绿素含量测定：步骤2处理下的3份玉米自交系，待3份玉米自交系干旱胁迫处理14d后取3株长势整齐一致的上述3份玉米自交系植株穗位叶，用5ml的95％乙醇避光浸泡每一处理下3份玉米自交系植株穗位叶中部0.1g至叶片发白为止，然后稀释10倍，采用北京普析tu-1810pc可见光紫外分光光度计，在665nm和649nm下测定相应材料的吸光值，再按照公式计算叶绿素a(chlorophylla,chla)的浓度、叶绿素b(chlorophyllb,chlb)的浓度(chla＝13.95×a665-6.88×a649,chlb＝24.96×a649-7.32×a655)和叶绿素a的含量(chlorophyllacontent,chlacontent)、叶绿素b的含量(chlorophyllbcontent,chlbcontent,chla/chlbcontent＝chla/chlb浓度×提取液体积×稀释倍数/样品鲜重/1000)，并计算总叶绿素含量(chlorophylla+bcontent,chla+bcontent)。类囊体的垛叠程度用叶绿素a/b(chlorophylla/b,chla/b)进行估测。

5.玉米穗位叶光合特性测定：步骤2处理下的3份玉米自交系，待3份玉米自交系干旱胁迫处理14d后取3株长势整齐一致的上述3份玉米自交系植株穗位叶，采用美国li-6400/xt(li-corinc.lincoln,nebraska,usa)便携式光合仪测定每一处理下3份玉米自交系植株穗位叶中部的净光合速率(pn)、气孔导度(gs)、胞间co2浓度(ci)、叶片温度(temperatureofleafthermocouple,tl)和蒸腾速率(transpirationrate,tr)。并按照以下公式计算rubpcase酶(rubp,rubp＝pn/ci)。光合特性具体测定时间选在晴天上午的9:00-11:00进行，par(photosyntheticactiveradiation)设为1000umol·m^-2·s^-1，co2浓度设为环境浓度。

6.结果分析：所有试验数据均采用ibmspss19.0(spssinc.,chicago,il,usa)软件统计分析，试验结果采用mean±sd(standarddeviation)表示，不同水旱处理下上述所测性状采用duncan法进行方差分析。

实施例2

本发明提供一种获得调控玉米光合特性主效qtl分子标记的方法，具体详细步骤如下：

1.群体构建：以强抗旱玉米自交系昌7-2、廊黄分别为母本，旱敏感自交系ts141为共同父本杂交获得2个f1杂交种，相应的f1杂交种自交获得2套分别含有218和202个单株的f2分离作图群体，之后相应的218和202个f2单株采用单籽粒传法两年自交获得含有218和202个株系2套qtl定位f4群体(pop-ct和pop-lt)，以备用于候选f2分离遗传图谱构建及f4群体玉米光合特性的田间鉴定。

2.ssr分子标记设计及亲本间多态性ssr分子标记筛选：从玉米基因组数据库maizegdb网站(http://www.maizegdb.org/)选择均匀分布于玉米10条染色体的ssr分子标记872对，由上海sangon合成。采用ctab法提取步骤1亲本昌7-2、廊黄、ts141幼苗的基因组dna，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，用德国implen微量分光光度仪检测dna浓度，用biometra-t1pcr仪进行pcr反应，采用10μl体系，即：dna(50ng/μl)0.7μl，primer1(1mmol/l)0.3μl，primer2(1mmol/l)0.3μl，2×powertaqpcrmastermix5.0μl，uph2o3.7μl。pcr反应程序为：95℃预变性5.0min，1个循环；94℃变性0.5min，50.0～59.3℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，共36个循环；最后72℃再延伸10min，并在4℃条件下结束保存90min。pcr扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行跑胶，银染，筛选出亲本间多态性的ssr标记，以备f2分离作图群体的全基因组扫描及构建相应群体的遗传图谱。

3.f2分离作图群体遗传图谱构建：步骤1构建的2套f2分离作图群体提取其幼苗的全基因组dna后，用步骤2筛选出的相应多态性ssr分子标记对2套相应的f2分离作图群体进行全基因组扫描分析，并采用joinmap4.0软件(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.joinmap/sc.evaluate/)构建遗传图谱，利用kosambi函数计算遗传距离(centimorgan,cm)。构建的2套相应的遗传图谱用于后续f4群体的qtl定位分析。

4.f4定位群体田间种植、管理及试验处理：2019年4月～9月于甘肃省农业科学院黄羊试验场(http://hyc.gsagr.ac.cn/channels/channel_503_1.html)种植上述步骤1所得的2套qtl定位f4群体pop-ct和pop-lt及亲本昌7-2、廊黄和ts141。由于该试验地玉米生育期内的蒸发量较大而平均相对湿度和降雨量较低，播前试验采用平膜(地膜规格：厚0.02mm，宽140cm)覆盖地表。试验设干旱胁迫环境处理(ds)和正常供水环境处理(ww)，每一处理均采用按完全随机区组设计，两次重复，单行区，每行20株，种植密度为55580株hm^-2。ds处理的pop-ct群体、pop-lt群体及昌7-2、廊黄、ts141等3个亲本在全生育期内完全依靠自然降水不供水，而ww处理的pop-ct群体、pop-lt群体及昌7-2、廊黄、ts141等3个亲本分别在玉米v18、r1和r3等3个生育期各灌水1次为4500m³·hm^-2。

5.f4定位群体光合特性的田间鉴定及统计分析：步骤4中的相应2套f4定位群体、3个亲本在干旱胁迫和正常供水环境处理下，待玉米授粉后在pop-ct群体、pop-lt群体及昌7-2、廊黄、ts141等3个亲本中选择长势整体一致的玉米10株，采用美国li-6400/xt(li-corinc.lincoln,nebraska,usa)便携式光合仪测定每一处理下相应pop-ct群体、pop-lt群体及昌7-2、廊黄、ts141等3个亲本穗位叶的净光合速率(pn)、气孔导度(gs)、胞间co2浓度(ci)、蒸腾速率(tr)，按公式计算rubpcase酶(rubp,rubp＝pn/ci)和水分利用效率(wue,wue＝pn/tr)。具体测定时间选择晴天上午9:00—11:00进行，par(photosyntheticactiveradiation)设为1000μmol·m^-2·s^-1，co2浓度设为380±5μmolco2mol^-1。采用ibm-spss19.0(spssinc.,chicago,il,usa)软件(https://www.ibm.com/products/spss-statistics)中的glm(generallinearmodelforunivariate)模型对单个环境下pop-ct群体、pop-lt群体及昌7-2、廊黄、ts141等3个亲本的pn、gs、ci、tr、rubp、wue等光合特性进行方差分析和pca(principalcomponentanalysis)主成分分析，并计算其峰度和偏度。按照以下公式计算pop-ct群体和pop-lt群体6个光合特性的广义遗传力(h²)和互作广义遗传力即：和式中：为基因型方差，为基因型与环境互作方差，为环境方差，为误差，n(n＝2)为环境个数，r为重复数(r＝10)。

6.f4定位群体光合特性的qtl定位分析：结合步骤5在2种水分环境下pop-ct群体218个株系及pop-lt群体202个株系中鉴定的6个光合特性表型值和步骤3构建的2套遗传图谱，采用windowsqtlcartographerversion2.5软件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm)中的复合区间作图法(cim)对单个水分环境下的该2套群体的6个光合特性进行qtl定位。就cim而言，采用zmapqtl程序模块model6，窗口大小为10.0cm，每隔0.5cm对6个光合特性进行基因型扫描，通过1000次抽样确定lod阈值(lod>3.0)。根据显性效应(d)与加性效应(a)之比的绝对值来估计qtl遗传效应：|d/a|＝0.00～0.20为加性(a)，|d/a|＝0.21～0.80为部分显性(pd)，|d/a|＝0.81～1.20为显性(d)，|d/a|>1.20为超显性(od)。采用qtlnetwork2.0软件(http://ibi.zju.edu.cn/software/qtlnetwork/)的基于混合线性模型的复合区间作图法(mcim)联合多个水分环境进行6个光合特性联合qtl定位，检测6个光合特性qtl与环境的互作(qtl×environmentalinteraction,qtl×e)效应。具体窗口大小设为10cm，permutation次数设为1000次，用f值(p<0.05)表示qtl的显著性。采用patentinversion3.5软件生成主效玉米光合特性qtl两端ssr分子标记序列表(如序列表所示)。

实施例3

本发明提供一种不同水分环境下玉米穗位叶气孔形态观察、叶绿素含量及光合特性测定的结果，具体观察和测定结果如下：

1.抗旱性不同玉米自交系穗位叶气孔形态的差异：正常供水环境处理下，3份抗旱性不同玉米自交系穗位叶的上/下表皮气孔个数、长度及宽度间差异显著(p<0.01或p<0.05)，抗旱自交系廊黄、昌7-2穗位叶的上/下表皮气孔个数显著多于(平均多8/20个)旱敏感自交系ts141，而上/下表皮气孔长度和宽度均显著短于(平均短0.17/9.26um和6.92/12.39um)ts141(图1和2)。暗示玉米的上/下表皮气孔个数、长度及宽度在抗旱性不同玉米自交系间不同，与抗旱自交系玉米相比，相同单位面积旱敏感自交系玉米的上/下表皮气孔个数较少，但由于旱敏感自交系玉米的叶片较大，就其相对叶片而言，旱敏感自交系玉米的上/下表皮气孔个数较多，且相同单位面积旱敏感自交系玉米的上/下表皮气孔长度和宽度均较长，意味着旱敏感自交系玉米叶片与外界环境进行气体和水分交换的能力大于抗旱自交系玉米。而在干旱胁迫环境处理下，3份抗旱性玉米自交系穗位叶的上/下表皮气孔个数显著升高外(p<0.01)，其上/下表皮气孔长度和宽度均显著降低(p<0.05)，且干旱胁迫下上/下表皮气孔个数、长度及宽度在不同抗旱性玉米自交系间的变化程度不同(p<0.01或p<0.05)(图1和2)。说明水分亏缺会显著影响抗旱性不同玉米自交系的上/下表皮气孔的排列和大小，以影响叶片的蒸腾、呼吸及光合性能。另外，缺水胁迫后，ts141和廊黄/昌7-2的上/下表皮气孔个数、长度及宽度分别平均降低了-15.56％和-9.43％、9.63％和19.24％、3.21％和21.85％、-9.84％和-5.08％、9.47％和7.43％、16.96％和5.65％。证实与旱敏感玉米自交系相比，抗旱玉米自交系上/下表皮气孔的长度和宽度降低更大，上/下表皮气孔个数升高更小。因此，抗旱性玉米自交系受干旱的影响均较旱敏感玉米自交系更小。

2.抗旱性不同玉米自交系穗位叶叶绿素含量的差异：正常供水环境处理下，3份抗旱性不同玉米自交系穗位叶的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量及叶绿素a/b间差异显著(p<0.01或p<0.05)，这4个性状均表现为廊黄>ts141>昌7-2(图3)。说明抗旱性不同玉米自交系的叶绿素含量间差异明显，其可能是不同抗旱性玉米自交系玉米叶绿素合成酶活性及叶绿素合成速率不同引起的。干旱胁迫环境处理下，抗旱玉米自交系廊黄、昌7-2穗位叶的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量均降低(p>0.05)，而旱敏感玉米自交系ts141的这3个性状均显著降低(p<0.01或p<0.05)(图3)。此外，廊黄和昌7-2在缺水处理下穗位叶的叶绿素a/b均升高(p>0.05)，而ts141的叶绿素a/b显著降低(p<0.05)(图3)。说明缺水能抑制不同抗旱性玉米自交系叶绿素合成酶活性及叶绿素合成速率，或能加速叶绿素降解酶活性及叶绿素降解速率。与旱敏感玉米自交系相比，干旱胁迫对抗旱玉米自交系叶绿素的影响程度更小。

3.抗旱性不同玉米自交系穗位叶光合特性的差异：3份抗旱性不同玉米自交系正常供水环境处理下，其穗位叶的气孔导度、净光合速率、胞间co2浓度、叶片温度、蒸腾速率及rubpcase活性在不同抗旱性玉米自交系间差异显著(p<0.01)，且旱敏感玉米自交系穗位叶的这6个性状分别是抗旱玉米自交系的1.12、1.12、1.29、1.11、0.98和0.94倍(图4)。揭示由于受基因型本身遗传特性的调控，导致不同抗旱性玉米自交系的气孔开度、光合性能、植株吸水与散热状况及类囊体的垛叠程度也不尽相同。此阶段干旱胁迫后，3份不同抗旱性玉米自交系穗位叶的胞间co2浓度则显著升高(p<0.01)外，其余5个性状均明显降低(p<0.01或p<0.05)，且抗旱玉米自交系廊黄和昌7-2的这6个性状在胁迫下的变化幅度远小于旱敏感玉米自交系ts141，其分别平均降低了10.14％和45.69％、14.64％和18.49％、-6.79％和-12.64％、7.07％和3.00％、1.99％和9.36％、32.74％和16.32％(图4)。说明干旱胁迫能显著抑制抗旱性不同玉米自交系的气孔开度、光合性能、植株吸水与散热状况及类囊体的垛叠程度，抗旱玉米自交系的这种抑制程度明显低于旱敏感玉米自交系，其耐旱能力将更强。

综上所述，干旱胁迫环境处理下，抗旱性不同玉米自交系穗位叶在其气孔形态、叶绿素含量及6个光合特性等方面显著存在差异，且在干旱胁迫下由于抗旱玉米自交系在气孔形态、叶绿素含量及光合特性等的方面的变化程度较小，抗旱玉米自交系具有更强的抗旱适应能力。因此，利用上述抗旱性不同的这3份玉米自交系构建qtl定位群体，可为不同水分环境下相应qtl定位群体的光合特性进行qtl定位奠定基础。

实施例4

本发明提供一种获得调控玉米光合特性主效qtl分子标记的结果，具体结果如下：

1.种植2套qtl定位f4群体的试验点气象数据：该试验地玉米生育期的平均气温为17.9℃，总日照时数为1427.6h，总降雨量为118.7mm，总蒸发量为1039.7mm，平均相对湿度为52.3％，平均风速为2.2m·s^-1(图5)。表明该试验地pop-ct群体、pop-lt群体的干旱胁迫环境和正常供水环境处理的差异较大。因此，在这2种水分环境下鉴定的2套pop-ct群体、pop-lt群体光合特性表型差异可能会较大，更有利于不同水分环境(ww/ds)下玉米光合特性主效qtl的确定。

2.不同水分环境处理下qtl定位群体光合特性的鉴定：同一水分环境(ww/ds)下，3个亲本玉米自交系的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶、水分利用效率等6个光合特性间差异显著(p<0.01或p<0.05)(表1)。说明抗旱性不同的这3份玉米自交系的光合特性间差异显著。在干旱胁迫环境处理下，这3份玉米自交系的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、rubpcase酶均呈降低趋势，而这3份玉米自交系的胞间co2浓度和水分利用效率均呈增大趋势，且在干旱胁迫环境下，旱敏感自交系ts141的这6个光合特性的变化幅度远大于抗旱自交系昌7-2和廊黄(表1)。说明为了减轻干旱胁迫对玉米造成的伤害，玉米的6个光合特性发生适应性的改变，且干旱胁迫环境下抗旱玉米自交系具有更强的光合特性。

表1不同水分环境下pop-ct群体、pop-lt群体及亲本昌7-2、廊黄、ts141的6个光合特性的测定值

注：不同大写/小写字母代表同一水分环境下相应2个亲本的单个光合特性在p<0.01/p<0.05水平下差异显著，**/*代表同一亲本的单个光合特性在不同水分环境下在p<0.01/p<0.05水平下差异显著。

3.qtl定位f4群体光合特性的遗传力分析：不同水分环境下(ww/ds)，2套qtl定位群体6个光合特性联合方差分析可知(表2)，pop-ct群体及pop-lt群体的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶、水分利用效率等6个光合特性在基因型间环境间基因型与环境互作间均达到了p<0.01或p<0.05水平差异显著，说明玉米的这6个光合特性显著受基因型、环境及基因型与环境互作效应的影响。此外，由表1、表2及图6可知，2种水分环境下pop-ct群体、pop-lt群体的这6个光合特性的偏度和峰度基本均介于-1.0～1.0之间，呈典型的连续正态分布，且pop-ct群体和pop-lt群体中的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度、蒸腾速率、rubpcase酶、水分利用效率的平均广义遗传力较大分别为83.726％、47.289％、90.956％、71.688％、65.659％和77.914％，平均互作广义遗传力较小分别为9.784％、11.872％、5.003％、17.673％、7.964％和6.108％。表明玉米的这6个光合特性是受多基因调控的数量遗传性状，且受基因型遗传效应的影响较大。因此对玉米的这6个光合特性进行qtl定位是可行的。

表2pop-ct群体及pop-lt群体6个光合特性的方差、广义遗传力及互作广义遗传力

基因型方差，环境方差，基因型与环境互作间，误差，h²：广义遗传力，互作广义遗传力。**/*代表p<0.01或p<0.05水平下差异显著。

4.qtl定位f4群体光合特性的pca主成分分析：在定位玉米光合特性qtl位点之前对玉米6个光合特性间的内在关系进行分析是非常有用的。在2种水分环境下对pop-ct群体及2个亲本的6个光合特性进行pca主成分分析可知(图7)，在正常供水环境下，6个主成分中前2个主成分的特征值大于1，且累计贡献率达到了62.231％，其中决定第一主成分的主要是净光合速率，可解释35.672％的贡献率，决定第二主成分的主要是蒸腾速率，可解释26.558％的贡献率。而在干旱胁迫环境下，6个主成分中前3个主成分的特征值大于1，且累计贡献率达到了88.371％，其中决定第一主成分的主要是净光合速率，可解释43.099％的贡献率，决定第二主成分的主要是rubpcase酶，可解释28.476％的贡献率，决定第三主成分的主要是水分利用效率，可解释16.796％的贡献率。此外，在2种水分环境下对pop-lt群体及2个亲本的6个光合特性进行pca主成分分析可知(图8)，在正常供水环境下，6个主成分中前2个主成分的特征值大于1，且累计贡献率达到了72.330％，其中决定第一主成分的主要是净光合速率、蒸腾速率和气孔导度，可解释48.662％的贡献率，决定第二主成分的主要是rubpcase酶，可解释23.668％的贡献率。而在干旱胁迫环境下，6个主成分中前2个主成分的特征值大于1，且累计贡献率达到了81.750％，其中决定第一主成分的主要是净光合速率、蒸腾速率和气孔导度，可解释54.174％的贡献率，决定第二主成分的主要是rubpcase酶，可解释27.576％的贡献率。说明不同水分环境，特别是干旱胁迫环境对玉米的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、rubpcase酶和水分利用效率的影响更大。因此在不同水分环境下对玉米的这些光合特性进行qtl定位是十分必要的。

5.亲本间多态性ssr标记筛选及相应的2套遗传图谱构建：872对ssr分子标记最终在亲本昌7-2与ts141间、在亲本廊黄与ts141间总共分别筛选出条带清晰、多态性好的ssr标记217和213对。然后分别利用这217和213对多态性ssr分子标记对昌7-2与ts141、廊黄与ts141构建的2套f2分离作图群体基因型进行全基因组扫描分析，构建了2套遗传群体，其中昌7-2与ts141杂交构建f2群体的遗传图谱含有205对ssr分子标记，覆盖了玉米的10个连锁群，总遗传距离为1648.8cm，分子标记间平均遗传距离为8.0cm(图9)。廊黄与ts141杂交构建f2群体的遗传图谱含有199对ssr分子标记，覆盖了玉米的10个连锁群，总遗传距离为1542.5cm，分子标记间平均遗传距离为7.8cm(图10)。该2套遗传图谱与ibm22008neighbors(http://www.maizegdb.org/data_center/map)参考图谱相比，所有ssr分子标记在参考图谱上的相对顺序高度一致。说明构建的该2套遗传图谱可靠，可用于后续qtl定位研究。

6.玉米1个调控净光合速率主效qtl(qpn-ch.1-1)的定位：通过qtl检测分析，pop-ct群体最终在2种水分环境下(ww/ds)同时定位到了1个调控玉米净光合速率的主效qtl，命名为qpn-ch.1-1，该主效qtl位于第一染色体的bin1.01处，介于ssr分子标记umc1177与umc2012之间，2种水分环境下该主效qtl的遗传效应均表现为部分显性(pd)，增强净光合速率的等位基因均来源于父本ts141，正常供水(ww)和干旱胁迫(ds)环境下该主效qtl的贡献率分别为10.65％和15.02％，累计贡献率为25.67％(表3和图11)。表明该qpn-ch.1-1为调控玉米净光合速率的主效qtl，且该主效qtl在干旱胁迫时对净光合速率的贡献更大，该主效qtl增强净光合速率的等位基因均来自于父本ts141，因此可用于对高光效利用玉米材料进行标记筛选，但由于该主效qtl的遗传效应为部分显性，因此在组配杂交种时要特别注意杂种优势对净光合速率的影响。

表3pop-ct群体净光合速率主效qtl(qpn-ch.1-1)定位信息

pd为部分显性遗传效应。

7.玉米1个调控气孔导度主效qtl(qgs-ch.1-1)的定位：不同水分环境下采用cim和mcim法对pop-lt群体的气孔导度进行了qtl定位。pop-lt群体在不同环境及多环境联合定位中同时检测到了1个调控玉米气孔导度的主效qtl，命名为qgs-ch.1-1，该主效qtl位于第一染色体的bin1.05_1.07处，介于ssr分子标记umc1395与umc1356间，所有环境及qtl检测方法下该主效qtl的累计贡献率为19.86％(表4、表5和图12)。采用cim法该主效qtl的遗传效应均表现为加性(a)，增大气孔导度的等位基因均来源于抗旱母本自交系廊黄。采用mcim法联合qtl分析未检测到该主效qtl与环境的互作效应(qtl×e)。表明该主效qgs-ch.1-1为调控玉米气孔导度的主效qtl，且该主效qtl在干旱胁迫时对气孔导度的贡献更大，该主效qtl增大气孔导度的等位基因均来自于抗旱母本自交系廊黄，因此可用于对具有适宜气孔导度且抗旱的玉米材料进行标记筛选，且由于该主效qtl的遗传效应为加性，因此在组配抗旱杂交种时应该充分考虑调控气孔导度基因的累加效应，进而获得综合抗旱能力最好的玉米杂交种。

表4不同水分环境下采用cim法pop-lt群体中气孔导度主效qtl(qgs-ch.1-1)定位信息

a为加性遗传效应。

表5多水分环境下采用mcim法pop-lt群体中气孔导度主效qtl(qgs-ch.1-1)定位信息

8.玉米1个调控水分利用效率主效qtl(qwue1)的定位：不同水分环境下采用cim和mcim法对2套群体(pop-ct、pop-lt)的水分利用效率进行了qtl定位。2套群体在不同环境及多环境联合定位中同时检测到了1个调控玉米水分利用效率的主效qtl，命名为qwue1，该主效qtl位于第一染色体的bin1.07_1.10处，介于ssr分子标记bnlg1025、mmc0041/phi308707及umc1847等间，所有环境及qtl检测方法下该主效qtl的累计贡献率为24.97％(表6、表7、图13和图14)。采用cim法该主效qtl的遗传效应均表现为显性(d)，增高水分利用效率的等位基因均来源于抗旱母本自交系昌7-2和廊黄。采用mcim法联合qtl分析未检测到该主效qtl与环境的互作效应(qtl×e)。表明该主效qwue1为调控玉米水分利用效率的主效qtl，且该主效qtl在干旱胁迫时对叶片水分利用效率的贡献更大，该主效qtl增高水分利用效率的等位基因均来自于抗旱母本自交系，因此可用于对高水分利用效率玉米材料进行标记筛选，但由于该主效qtl的遗传效应为显性，因此在组配杂交种时要特别注意杂种优势对水分利用效率的影响。

表6不同水分环境下采用cim法pop-ct和pop-lt群体中叶片水分利用效率主效qtl(qwue1)定位

d为显性遗传效应。

表7多水分环境下采用mcim法pop-ct和pop-lt群体中叶片水分利用效率主效qtl(qwue1)定位

实施例5

本发明提供一种调控玉米光合特性主效qtl的分子标记在玉米分子标记辅助选择育种中的应用方法，具体步骤如下：

1.一种调控玉米净光合速率主效qtl的分子标记在玉米高光效分子标记辅助选择育种中的应用方法：上述调控玉米净光合速率主效qtl(qpn-ch.1-1)的ssr分子标记，由umc1177和umc2012两对ssr分子标记组成，其中ssr分子标记umc1177的序列为：

forward:5’-cgtgtaccgctcctctatagtcgt-3’

reverse:5’-aagtggccgaattcatcctttatt-3’

所述ssr分子标记引物umc2012的序列为：

forward:5’-cttgcattgaacgacgacctg-3’

reverse:5’-cgtacgcttgcaatgcttctct-3’。

从上述实施例可以看出，利用上述调控玉米净光合速率主效qtl的ssr分子标记辅助选择高光效利用玉米材料的方法包括：提取待测玉米基因组dna，用ssr分子标记umc1177和umc2012进行pcr扩增，当得到长度为96bp和149bp的扩增产物，则待测玉米为候选高光效利用(净光合速率强)的玉米单株，淘汰其它单株，有目的的组配杂交组合，选育出高密度种植条件高光效利用高产的玉米优良新品种，进而应用于生产实践中，应用潜力巨大。

2.一种调控玉米气孔导度主效qtl的分子标记在玉米气孔导度相对较大且抗旱分子标记辅助选择育种中的应用方法：上述调控玉米气孔导度主效qtl(qgs-ch.1-1)的ssr分子标记，由umc1395和umc1356两对ssr分子标记组成，其中所述ssr分子标记引物umc1395的序列为：

forward:5’-tgaatgagtggcattcaaaatctg-3’

reverse:5’-cagattgcatgtgtgagtgtgtgt-3’

所述ssr分子标记引物umc1356的序列为：

forward:5’-atacatttttacgtccacgccg-3’

reverse:5’-ctaggatagtaggagtgcagggca-3’。

从上述实施例可以看出，利用上述调控玉米气孔导度主效qtl的ssr分子标记辅助选择气孔开度适当(气孔导度相对较大)且抗旱玉米材料的方法包括：提取待测玉米基因组dna，用ssr分子标记umc1395和umc1356进行pcr扩增，当得到长度为203bp和148bp的扩增产物，则待测玉米为候选气孔导度相对较大且抗旱的玉米单株，淘汰其它单株，有目的的组配杂交组合，选育出抗旱、高产的玉米优良新品种，进而应用于生产实践中，应用潜力巨大。

3.一种调控玉米水分利用效率效qtl的分子标记在抗旱高产分子标记辅助选择育种中的应用方法：上述调控玉米水分利用效率主效qtl(qwue1)的ssr分子标记，由bnlg1025、mmc0041、phi308707和umc1847四对ssr分子标记组成，其中所述ssr分子标记引物bnlg1025的序列为：

forward:5’-tggtgaaggggaagatgaag-3’

reverse:5’-ccgagacgtgactcctaagc-3’

所述ssr分子标记引物mmc0041的序列为：

forward:5’-aggacttagagaggaaacgaa-3’

reverse:5’-tttatccttacttgcagttgc-3’

所述ssr分子标记引物phi308707的序列为：

forward:5’-gcaacaagatccagccgat-3’

reverse:5’-gtcgccctcatatgaccttc-3’

所述ssr分子标记引物umc1847的序列为：

forward:5’-gcccaaggtagatttttactctcca-3’

reverse:5’-aagtcgtagagctcgtcgtgatg-3’。

从上述实施例可以看出，利用上述调控玉米水分利用效率主效qtl的ssr分子标记辅助选择高水分利用效率玉米材料的方法包括：提取待测玉米基因组dna，用ssr分子标记bnlg1025、mmc0041、phi308707和umc1847进行pcr扩增，当得到长度为194bp、146bp、121bp、153bp的扩增产物，则待测玉米为候选高水分利用效率的玉米单株，淘汰其它单株，有目的的组配杂交组合，选育出抗旱、高产的玉米优良新品种，进而应用于生产实践中，应用潜力巨大。

<110>甘肃农业大学

<120>调控玉米光合特性主效qtl的分子标记及其应用

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<213>玉米（zeamaysl.)

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<213>玉米（zeamaysl.）

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<213>玉米（zeamaysl.）

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