一种用于RNA恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及致病菌微生物检测技术领域，具体涉及一种基于rna恒温扩增检测牛支原体快速检测技术，特别涉及检测牛支原体的特异性检测引物和探针、试剂盒及检测方法。

背景技术：

牛支原体(mycoplasmabovis，m.bovis，mb)，属于支原体属，近些年来，由于乳液的蓬勃发展，带动大规模养牛业迅速发展，而随之牛支原体这种对养牛业造成巨大威胁的致病支原体引起人们的广泛关注，可以使牛产生牛肺炎、乳腺炎、关节炎和生殖道炎症等疾病，严重的会使牛流产与不孕，尤其引起的牛肺疫更是一种烈性接触传染病，虽然我国经认证彻底消灭此病，但对于全球来说其危害依旧令养牛业不可忽视，给养牛业带来了巨大的经济损失。因此，快速检测牛乳中的牛支原体，不仅能够及时有效地预防治疗相关病牛减少损失，同时也是保障养牛业蓬勃发展的必要手段。

近年来，食源性致病菌的快速检测和鉴定方法发展较为迅速，以免疫学为基础的elisa技术、免疫磁珠技术、全自动免疫酶标检测系列、免疫胶体金技术等，以分子生物学为基础的rna指纹图谱技术、实时荧光pcr技术、基因芯片技术等，以纸片法为代表的细菌代谢为基础的酶触反应技术等，这些快速检测方法大大缩短了致病菌检验的时间，提高了检验效率，但也存在一些问题难以解决。国标培养法检测牛支原体需要4～7天，行标实时荧光pcr法需要2～5天，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(sat)检测牛支原体需要6小时，基于核酸序列的扩增技术(nucleicacidsequencebasedamplification，nasba)和转录介导的扩增技术(transcriptionmediatedamplification，tma)暂无相关牛支原体rna检测试剂盒。

传统牛支原体检测方法由于菌浓度较低且培养条件要求较高，耗费时间长、检验效率低，从而导致不能及时监控牛支原体，不能实现现场检测。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述缺点，本发明提供一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法，实现对牛支原体的现场快速、准确的检测。根据本发明的方法，检测仅仅需要大约150min。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针，所述引物包括：上游引物mbnt7包含：ctgaccttcgggtaaagc，或tggtttgtcgcgttgttc，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；下游引物mbt7包含：t7启动子序列和靶标引物序列；其中所述标靶引物序列包含ccacaccgctagagc，或accaggaattccagt，或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；其中所述t7启动子序列包含aatttaatacagctcactatagggaga，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；其中所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。

根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团，优选所述荧光基团包含fam、hex或vic，所述淬灭基团包含dabcyl。

根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含cugcgggacccagggaugcaugucgcag，或ctgcgagcgtgcgggcgatacgggcagcgcag，或其同源序列中的至少10个核苷酸。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。

一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有所述引物和探针的检测液，以及含有t7rna聚合酶和m-mlv反转录酶的酶液。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；检测液：所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；和

酶液：所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：所述反应液包含10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

检测液：所述检测液包含10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，depc水。

酶液：所述酶液包含1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒还包括裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0。

根据本发明的某些实施方式，所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含的捕获探针为oligo(dt)。

根据本发明的某些实施方式，所述oligo(dt)的长度是10-26。

根据本发明的某些实施方式，所述oligo(dt)的长度是18。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds。

根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna。

根据本发明的某些实施方式，所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒还包括：

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒还包括：

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针，优选所述捕获探针为oligo(dt)；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒还包括：

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针，优选所述捕获探针为oligo(dt)，优选所述oligo(dt)的长度是10-26；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

检测液：所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

酶液：所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa；

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

检测液：所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

酶液：所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa；

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针，优选所述捕获探针为oligo(dt)；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

检测液：所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

酶液：所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa；

裂解液：所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针，优选所述捕获探针为oligo(dt)，优选所述oligo(dt)的长度是10-26；

洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

阳性对照：所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；和

阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，depc水。

酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；

洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

阴性对照：生理盐水。

根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：

反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，depc水。

酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；所述oligo(dt)的长度是18；

洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

阴性对照：生理盐水。

本发明还提供了一种使用所述试剂盒检测牛支原体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待检样品中的靶标rna；

(2)利用所述引物和探针对待检样品中的靶标rna进行rna恒温扩增；

(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果：ct＜60的样本为阳性；ct无数值或为60的样本为阴性。

根据本发明的某些实施方式，所述检测使用fam通道、hex通道、或vic通道。

根据本发明的某些实施方式，所述扩增的反应体系是反应液和检测液的混合。

根据本发明的某些实施方式，所述扩增的反应条件为荧光pcr仪中42℃±1℃反应40～60min。

根据本发明的某些实施方式，所述提取待检样品中的靶标rna包括(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有靶标rna的裂解后的菌体；和(2)向步骤(1)的裂解液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标rna结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标rna。

根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标rna进行rna恒温扩增包括将步骤(2)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，所述第一次温育是在62℃±2℃下温育5～10min，所述第二次温育是在40±1℃下温育5～10min，然后加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化。

根据本发明的某些实施方式，所述方法包括：

(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有靶标rna的裂解溶液；向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标rna结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标rna；

(2)将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，所述第一次温育是在62℃±2℃下温育5～10min，所述第二次温育是在40±1℃下温育5～10min，然后加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；

(3)根据荧光信号产生的时间和强度，记录待检样品反应的ct值：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果：ct＜60的样本为阳性；ct无数值或为60的样本为阴性。

根据本发明的某些实施方式，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有牛支原体，阴性则样品中没有牛支原体。

发明详述

用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针

本发明提供了一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针，所述引物的下游引物包括t7启动子。

根据本发明的某些实施方式，上游引物mbnt7(不包含启动子的引物)序列包含：ctgaccttcgggtaaagc，或tggtttgtcgcgttgttc，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；所述下游引物mbt7(包含t7启动子的引物)序列包含：t7启动子序列，和靶标引物序列；其中所述标靶引物序列包含ccacaccgctagagc，或accaggaattccagt，或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；其中所述t7启动子序列包含aatttaatacagctcactatagggaga，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有至少70％相同的核苷酸序列，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。

根据本发明的某些实施方式，所述上游引物mbnt7序列包含至少10个核苷酸序列，例如至少12个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述下游引物mbt7中的靶标引物序列包含至少8个核苷酸序列，例如至少8个、至少10个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述下游引物mbt7中的t7启动子序列包含至少10个核苷酸序列，例如至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述下游引物mbt7中，所述t7启动子序列位于所述靶标引物序列的5’末端。

根据本发明的某些实施方式，所述下游引物mbt7中，所述t7启动子序列位于所述靶标引物序列的3’末端。

根据本发明的某些实施方式，所述引物序列为：

上游引物为：ctgaccttcgggtaaagc；

下游引物为：aatttaatacagctcactatagggagaccacaccgctagagc。

根据本发明的某些实施方式，所述探针为荧光探针，其序列为：cugcgggacccagggaugcaugucgcag。

根据本发明的某些实施方式，所述探针为荧光探针。

根据本发明的某些实施方式，所述探针为分子信标。

根据本发明的某些实施方式，所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。

根据本发明的某些实施方式，所述探针具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构。

根据本发明的某些实施方式，所述探针的环部分和靶标互补。

根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团。

根据本发明的某些实施方式，所述荧光探针为分子信标，所述分子信标具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。

根据本发明的某些实施方式，所述探针具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。

根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含：cugcgggacccagggaugcaugucgcag，或ctgcgagcgtgcgggcgatacgggcagcgcag，或其同源序列中的至少10个核苷酸。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有至少70％相同的核苷酸序列，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。

根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含至少10个核苷酸序列，例如至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少27个、至少30个、至少32个核苷酸序列。

优选的，所述探针5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

优选的，所述探针5’端含有淬灭基团，3’端含有荧光基团。

优选的，所述荧光基团包含fam、hex或vic。

优选的，所述淬灭基团包含dabcyl。

优选的，所述探针5’端用fam、hex或vic标记，3’端用dabcyl标记。优选的，所述荧光探针5’端用dabcyl标记，3’端用fam、hex或vic标记。

试剂盒

本发明还提供了一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有上述技术方案所述引物和探针的检测液，以及含有t7rna聚合酶和m-mlv反转录酶的酶液。

本发明中，所述反应液和所述检测液组成的溶液又称为扩增反应液。

优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

反应液

优选的，所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2～10mmol/ltrishcl，例如4～10mmol/l、6～10mmol/l、8～10mmol/l、2～8mmol/l、4～8mmol/l、6～8mmol/l、2～6mmol/l、4～6mmol/l或2～4mmol/ltrishcl。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/ltrishcl。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含20～40mmol/lmgcl2，例如20～35mmol/l、20～30mmol/l、20～25mmol/l、25～40mmol/l、25～35mmol/l、25～30mmol/l、30～40mmol/l、30～35mmol/l或35～40mmol/lmgcl2。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、35mmol/l、40mmol/lmgcl2。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5～5mmdntps，例如0.5～4mm、0.5～3mm、0.5～2mm、0.5～1mm、1～5mm、1～4mm、1～3mm、1～2mm、2～5mm、2～4mm、2～3mm、3～5mm、3～4mm或4～5mmdntps。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mmdntps。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1～10mmntps，例如1～8mm、1～5mm、1～3mm、3～10mm、3～8mm、3～5mm、5～10mm、5～8mm或8～10mmntps。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mmntps。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2.5～2.7mmol/lkcl，例如2.5～2.6mmol/l或2.6～2.7mmol/lkcl。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2.5mmol/l、2.51mmol/l、2.52mmol/l、2.53mmol/l、2.54mmol/l、2.55mmol/l、2.56mmol/l、2.57mmol/l、2.58mmol/l、2.59mmol/l、2.6mmol/l、2.61mmol/l、2.62mmol/l、2.63mmol/l、2.64mmol/l、2.65mmol/l、2.66mmol/l、2.67mmol/l、2.68mmol/l、2.69mmol/l或2.7mmol/lkcl。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2～10mmol/lna2hpo4，例如4～10mmol/l、6～10mmol/l、8～10mmol/l、2～8mmol/l、4～8mmol/l、6～8mmol/l、2～6mmol/l、4～6mmol/l或2～4mmol/lna2hpo4。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/lna2hpo4。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5～2mmol/lkh2po4，例如0.5～1.5mmol/l、0.5～1.0mmol/l、1.0～2mmol/l、1.0～1.5mmol/l、1.5～2mmol/lkh2po4。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l、0.8mmol/l、0.9mmol/l、1mmol/l、1.1mmol/l、1.2mmol/l、1.3mmol/l、1.4mmol/l、1.5mmol/l、1.6mmol/l、1.7mmol/l、1.8mmol/l、1.9mmol/l或2mmol/lkh2po4。

根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4。

含有引物和探针的检测液

优选的，所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/l上游引物mbnt7，例如5～12pmol/l、5～10pmol/l、5～8pmol/l、8～15pmol/l、8～12pmol/l、8～10pmol/l、10～15pmol/l、10～12pmol/l、12～15pmol/l上游引物mbnt7。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/l、6pmol/l、7pmol/l、8pmol/l、9pmol/l、10pmol/l、11pmol/l、12pmol/l、13pmol/l、14pmol/l或15pmol/l上游引物mbnt7。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/l下游引物mbt7，例如5～12pmol/l、5～10pmol/l、5～8pmol/l、8～15pmol/l、8～12pmol/l、8～10pmol/l、10～15pmol/l、10～12pmol/l、12～15pmol/l下游引物mbt7。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/l、6pmol/l、7pmol/l、8pmol/l、9pmol/l、10pmol/l、11pmol/l、12pmol/l、13pmol/l、14pmol/l或15pmol/l下游引物mbt7。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～10pmol/lmb荧光探针，例如5～8pmol/l或8～10pmol/lmb荧光探针。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/l、6pmol/l、7pmol/l、8pmol/l、9pmol/l或10pmol/lmb荧光探针。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含1～5mmol/ltris-hclph8.0，例如1～2.5mmol/l或2.5～5mmol/ltris-hclph8.0。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含1mmol/l、1.5mmol/l、2mmol/l、2.5mmol/l、3mmol/l、3.5mmol/l、4mmol/l、4.5mmol/l或5mmol/ltris-hclph8.0。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含1～5mmol/ledta，例如1～2.5mmol/l或2.5～5mmol/ledta。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含1mmol/l、1.5mmol/l、2mmol/l、2.5mmol/l、3mmol/l、3.5mmol/l、4mmol/l、4.5mmol/l或5mmol/ledta。

根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，余量为depc水。

含有t7rna聚合酶和m-mlv反转录酶的酶液

优选的，所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1000u/反应m-mlv反转录酶，例如500～900u/反应、500～800u/反应、500～700u/反应、500～600u/反应、600～1000u/反应、600～900u/反应、600～800u/反应、600～700u/反应、700～1000u/反应、700～900u/反应、700～800u/反应、800～1000u/反应、800～900u/反应或900～1000u/反应m-mlv反转录酶。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500u/反应、550u/反应、600u/反应、650u/反应、700u/反应、750u/反应、800u/反应、850u/反应、900u/反应、950u/反应或1000u/反应m-mlv反转录酶。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1500u/反应t7rna聚合酶，例如500～1200u/反应、500～1000u/反应、500～800u/反应、800～1500u/反应、800～1200u/反应、800～1000u/反应、1000～1500u/反应、1000～1200u/反应或1200～1500u/反应t7rna聚合酶。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500u/反应、600u/反应、700u/反应、800u/反应、900u/反应、1000u/反应、1100u/反应、1200u/反应、1300u/反应、1400u/反应或1500u/反应t7rna聚合酶。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，例如0.5～0.8mmol/l或0.8～1mmol/ltris-hclph8.0。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l、0.8mmol/l、0.9mmol/l或1mmol/ltris-hclph8.0。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2.5～2.7mmol/lkcl，例如2.5～2.6mmol/l或2.6～2.7mmol/lkcl。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2.5mmol/l、2.51mmol/l、2.52mmol/l、2.53mmol/l、2.54mmol/l、2.55mmol/l、2.56mmol/l、2.57mmol/l、2.58mmol/l、2.59mmol/l、2.6mmol/l、2.61mmol/l、2.62mmol/l、2.63mmol/l、2.64mmol/l、2.65mmol/l、2.66mmol/l、2.67mmol/l、2.68mmol/l、2.69mmol/l或2.7mmol/lkcl。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5～1mmol/ledta，例如0.5～0.8mmol/l或0.8～1mmol/ledta。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l、0.8mmol/l、0.9mmol/l或1mmol/ledta。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2％～10％bsa，例如2％～8％、2％～5％、5％～10％、5％～8％或8％～10％bsa。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％bsa。

根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa。

优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

裂解液

优选的，所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含10％～20％tritonx-100，例如10％～15％或15％～20％tritonx-100。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％tritonx-100。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，例如2mol/l～8mol/l、2mol/l～5mol/l、5mol/l～10mol/l、5mol/l～8mol/l或8mol/l～10mol/l异硫氰酸胍。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含2mol/l、3mol/l、4mol/l、5mol/l、6mol/l、7mol/l、8mol/l、9mol/l或10mol/l异硫氰酸胍。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含2～10mmol/ltrishcl，例如4～10mmol/l、6～10mmol/l、8～10mmol/l、2～8mmol/l、4～8mmol/l、6～8mmol/l、2～6mmol/l、4～6mmol/l或2～4mmol/ltrishcl。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/ltrishcl。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液的ph是ph2.0～ph9.0，例如ph2.0～ph7.0、ph2.0～ph5.0、ph5.0～ph9.0、ph5.0～ph7.0或ph7.0～ph9.0。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液的ph是ph2.0、ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph8.0或ph9.0。

根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0。

核酸提取液

优选的，所述核酸提取液包含40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含40～200mmedta，例如40～150mm、40～100mm、40～60mm、60～200mm、60～150mm、60～100mm、100～200mm、100～150mm或150～200mmedta。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm或200mmedta。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含50～500mg/l磁珠，例如50～400mg/l、50～300mg/l、50～200mg/l、50～100mg/l、100～500mg/l、100～400mg/l、100～300mg/l、100～200mg/l、200～500mg/l、200～400mg/l、200～300mg/l、300～500mg/l、300～400mg/l或400～500mg/l磁珠。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、90mg/l、100mg/l、130mg/l、150mg/l、180mg/l、200mg/l、230mg/l、250mg/l、280mg/l、300mg/l、330mg/l、350mg/l、380mg/l、400mg/l、430mg/l、450mg/l、480mg/l或500mg/l磁珠。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含1～50μm捕获探针，例如1～40μm、1～30μm、1～20μm、1～10μm、10～50μm、10～40μm、10～30μm、10～20μm、20～50μm、20～40μm、20～30μm、30～50μm、30～40μm或40～50μm捕获探针。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm捕获探针。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含的捕获探针为oligo(dt)。

根据本发明的某些实施方式，所述oligo(dt)的长度是10-26，例如10-20、10-18、10-15、10-12、12-26、12-20、12-18、12-15、15-26、15-20、15-18、18-26、18-20或20-26。根据本发明的某些实施方式，所述oligo(dt)的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针，所述捕获探针为oligo(dt)。

根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针，所述捕获探针为oligo(dt)，所述oligo(dt)的长度是18。

洗涤液

优选的，所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～2.5mmol/lnacl，例如2～2.3mmol/l或2.3～2.5mmol/lnacl。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/l、2.1mmol/l、2.2mmol/l、2.3mmol/l、2.4mmol/l或2.5mmol/lnacl。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，例如4～10mmol/l、6～10mmol/l、8～10mmol/l、2～8mmol/l、4～8mmol/l、6～8mmol/l、2～6mmol/l、4～6mmol/l或2～4mmol/l异硫氰酸胍。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/l异硫氰酸胍。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～10mmol/ltrishcl，例如4～10mmol/l、6～10mmol/l、8～10mmol/l、2～8mmol/l、4～8mmol/l、6～8mmol/l、2～6mmol/l、4～6mmol/l或2～4mmol/ltrishcl。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l或10mmol/ltrishcl。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液的ph是ph7.0～ph9.0，例如ph7.0～ph8.0或ph8.0～ph9.0。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液的ph是ph7.0、ph7.5、ph8.0、ph8.5或ph9.0。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2％～10％sds，例如2％～8％、2％～5％、5％～10％、5％～8％或8％～10％sds。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％sds。

根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds。

对照

优选的，所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna。

根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna，例如10⁴～10⁵拷贝/ml或10⁵～10⁶拷贝/ml牛支原体rna。根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含10⁴拷贝/ml、10⁵拷贝/ml或10⁶拷贝/ml牛支原体rna。

优选的，所述阴性对照包含生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

(2)核酸提取液：40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；

(3)洗涤液：2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

(4)反应液：2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

(6)酶液：500～1000u/反应m-mlv反转录酶、500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，10％bsa；

(7)阳性对照：10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；

(8)阴性对照：生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

(2)核酸提取液：40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；所述捕获探针为oligo(dt)；

(3)洗涤液：2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

(4)反应液：2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

(6)酶液：500～1000u/反应m-mlv反转录酶、500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，10％bsa；

(7)阳性对照：10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；

(8)阴性对照：生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％～20％tritonx-100，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph2.0～ph9.0；

(2)核酸提取液：40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；所述捕获探针为oligo(dt)，所述oligo(dt)的长度是10-26；

(3)洗涤液：2～2.5mmol/lnacl，2mol/l～10mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0，2％～10％sds；

(4)反应液：2～10mmol/ltrishcl，20～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；

(6)酶液：500～1000u/反应m-mlv反转录酶、500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，10％bsa；

(7)阳性对照：10⁴～10⁶拷贝/ml牛支原体rna；

(8)阴性对照：生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

(2)核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；

(3)洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

(4)反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，余量为depc水。

(6)酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

(7)mb阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

(8)mb阴性对照：生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

(2)核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；所述捕获探针为oligo(dt)；

(3)洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

(4)反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，余量为depc水。

(6)酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

(7)mb阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

(8)mb阴性对照：生理盐水。

进一步优选的，所述试剂盒中包括：

(1)裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0：

(2)核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；所述捕获探针为oligo(dt)，所述oligo(dt)的长度是18；

(3)洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

(4)反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，余量为depc水。

(6)酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

(7)mb阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

(8)mb阴性对照：生理盐水。

牛支原体的检测方法

本发明还提供了一种使用所述试剂盒检测牛支原体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待检样品中的靶标rna；

(2)利用上述技术方案所述的引物和探针对待检样品中的靶标rna进行rna恒温扩增；

(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果：ct＜60的样本为阳性；ct无数值或为60的样本为阴性。

根据ct值判定是否含有牛支原体靶标rna。55＜ct＜60的ct值为灰区即临界值，需要复检确认。

根据本发明的某些实施方式，所述检测使用fam通道、hex通道、或vic通道。

根据本发明的某些实施方式，所述探针包含fam荧光标记时，所述检测使用fam通道。根据本发明的某些实施方式，所述探针包含hex荧光标记时，所述检测使用hex通道。根据本发明的某些实施方式，所述探针包含vic荧光标记时，所述检测使用vic通道。

优选的，所述待检样品为食品。

优选的，所述食品可能感染牛支原体。

优选的，所述扩增反应体系为反应液和检测液的混合。

优选的，所述扩增的反应条件为荧光pcr仪中42℃±1℃反应40～60min。

优选的，所述扩增的反应条件为荧光pcr仪中是在42℃±1℃反应，例如在41-42℃或42-43℃反应。优选的，所述扩增的反应条件为荧光pcr仪中是在41℃、42℃或43℃反应。

优选的，所述扩增的反应条件为荧光pcr仪中反应40～60min，例如40～50min或50～60min。优选的，所述扩增反应条件为荧光pcr仪中反应40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min或60min。

根据本发明的某些实施方式，所述提取待检样品中的靶标rna包括用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有靶标rna的裂解溶液；向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标rna结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标rna。

根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标rna进行rna恒温扩增包括将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，所述第一次温育是在62℃±2℃下温育5～10min，所述第二次温育是在40±1℃下温育5～10min，然后加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化。

优选的，所述牛支原体的检测方法由上述技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：

(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有靶标rna的裂解溶液向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标rna结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标rna；

(2)将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，所述第一次温育是在62℃±2℃下温育5～10min，所述第二次温育是在40±1℃下温育5～10min，然后加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；

(3)根据荧光信号产生的时间和强度，记录待检样品反应的ct值：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果：ct＜60的样本为阳性；ct无数值或为60的样本为阴性。

根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第一次温育是在62℃±2℃下温育，例如60-62℃或62-64℃下温育。根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第一次温育是在60℃、61℃、62℃、63℃或64℃下温育。

根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(2)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第一次温育是温育5～10min，例如温育5～8min或8～10min。根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第一次温育是温育5min、6min、7min、8min、9min或10min。

根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第二次温育是在40±1℃下温育，例如39-40℃或40-41℃下温育。根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第二次温育是在39℃、40℃或43℃下温育。

根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第二次温育是温育5～10min，例如温育5～8min或8～10min。根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述第二次温育是温育5min、6min、7min、8min、9min或10min。

根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述加入所述酶液，在42℃±1℃下反应，例如在41-42℃或42-43℃下反应。根据本发明的某些实施方式，(2)中将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，所述加入所述酶液，41℃、42℃或43℃下反应。

根据本发明的某些实施方式，(3)中ct≤55的样本为阳性，例如ct≤54、ct≤53、ct≤52、ct≤51、ct≤50、ct≤45、ct≤40、ct≤35、ct≤30、ct≤25、ct≤20、ct≤15、ct≤10、ct≤5的样本为阳性。根据本发明的某些实施方式，(4)中ct≤55的样本为阳性，例如ct是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55的样本为阳性。

根据本发明的某些实施方式，(3)中55＜ct＜60的样本建议重新检测，例如55＜ct＜59、55＜ct＜58、55＜ct＜57、55＜ct＜56、56＜ct＜60、56＜ct＜59、56＜ct＜58、56＜ct＜57、57＜ct＜60、57＜ct＜59、57＜ct＜58、58＜ct＜60、58＜ct＜59、59＜ct＜60的样本建议重新检测。根据本发明的某些实施方式，(3)中ct是56、57、58或59的样本建议重新检测。

根据本发明的某些实施方式，(3)复检结果中ct＜60的样本为阳性，例如ct＜59、ct＜58、ct＜57、ct＜56、ct＜55、ct＜54、ct＜53、ct＜52、ct＜51、ct＜50、ct＜45、ct＜40、ct＜35、ct＜30、ct＜25、ct＜20、ct＜15、ct＜10或ct＜5的样本为阳性。根据本发明的某些实施方式，(4)复检结果中ct＜60的样本为阳性，例如ct是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59的样本为阳性。

根据本发明的某些实施方式，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定。

根据本发明的某些实施方式，阳性检测结果表示样品中有牛支原体活菌；阴性检测结果表示样品中没有牛支原体活菌。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测牛支原体的方法，与现有的mb检测相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性：本发明针对mb靶核酸设计的特异性荧光探针，可高效、特异性检测mb的rna；

(2)高灵敏度：本发明以rna为模板扩增，菌株基底rna浓度是dna的1000倍，灵敏度可达10²拷贝/ml；

(3)快速检测：本发明将核酸的扩增与检测同步进行，扩增效率高，以100～1000拷贝/循环速率扩增，15～30分钟可将模板放大10⁹倍。而且整个过程为恒温，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50min，培养加检测150min即可得到结果，相比国标法时间大大缩短。

(4)能有效区别检测物中的死菌和活菌，检测更准确，更科学，避免假阳性。

(5)污染易控：与实时荧光pcr相比，本发明的扩增产物是rna，rna在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(6)设备简单，成本低：与实时荧光定量pcr相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

可见，本发明试剂盒能够检测食品样本中的mbrna，具有特异性高、灵敏度高(可达10²拷贝/ml)、准确(避免假阳性)检测、污染低(扩增产物rna在自然环境下易于降解)及快速检测(150min完成扩增检测的特点，将在牛支原体快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明：

图1为本发明实施例3中灵敏度检测结果；

图2为本发明实施例4中特异性检测结果；

图3为本发明实施例5中食品样本的检测结果；和

图4为本发明实施例6中mb靶标rna灭菌后的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了上述技术方案中利用rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针，所述引物和探针均为特异性序列，可特异性检测牛支原体。

本发明所述引物的序列分别为：

上游引物为mbnt7(不包含启动子的引物)：ctgaccttcgggtaaagc；或tggtttgtcgcgttgttc；

下游引物为mbt7(包含t7启动子的引物)：aatttaatacagctcactatagggagaccacaccgctagagc；或aatttaatacgactcactatagggagaaccaggaattccagt；其中，下游引物上具有t7rna聚合酶识别的启动子序列aatttaatacagctcactatagggaga。

在本发明中，所述mb荧光探针为分子信标，是具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和标靶互补，两头由于互补而成为茎。

本发明所述探针的核酸分子序列为：cugcgggacccagggaugcaugucgcag；或ctgcgagcgtgcgggcgatacgggcagcgcag。

本发明所述mb荧光探针5’端用fam荧光基团标记，3’端用dabcyl淬灭基团标记。

探针遇到靶标rna探针将优先和靶rna结合而不是形成发夹结构，由于茎结构被破坏，荧光报告物质与猝灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光。探针在没有靶rna存在的情况下荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一起，不发射荧光，因而背景很低。

本发明提供了一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的试剂盒，所述试剂盒包括反应液、含有上述技术方案所述引物和探针的检测液、含有t7rna聚合酶和m-mlv反转录酶的酶液，还包括裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

优选的，本发明用于rna恒温扩增检测牛支原体的试剂盒中，包括以下各种试剂：

(1)裂解液：10％～20％tritonx-100，4.5mol/l～5mol/l异硫氰酸胍，2～10mmol/ltrishcl，ph7.0～9.0；更优选裂解液为：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

(2)核酸提取液：40～200mmedta，50～500mg/l磁珠，1～50μm捕获探针；更优选核酸提取液为：150mmedta，400mg/l磁珠，40μm捕获探针；

(3)洗涤液：2～2.5mmol/lnacl，4.5mol/l～5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；更优选洗涤液为：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

(4)反应液：2～10mmol/ltrishcl，10～40mmol/lmgcl2，0.5～5mmdntps，1～10mmntps，2.5～2.7mmol/lkcl，2～10mmol/lna2hpo4，0.5～2mmol/lkh2po4；更优选反应液为10mmol/ltrishcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，5mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

(5)检测液：5～15pmol/l上游引物mbnt7，5～15pmol/l下游引物mbt7，5～10pmol/lmb荧光探针，1～5mmol/ltris-hclph8.0，1～5mmol/ledta，余量为depc水；更优选检测液为：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，10pmol/lmb荧光探针，1mmol/ltris-hclph8.0，0.25mmedta，depc水；

(6)酶液：500～1000u/反应m-mlv反转录酶、500～1500u/反应t7rna聚合酶，0.5～1mmol/ltris-hclph8.0，2.5～2.7mmol/lkcl，0.5～1mmol/ledta，2％～10％bsa；更优选酶液为：500u/反应m-mlv反转录酶、500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris-hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta.10％bsa；

(7)阳性对照：牛支原体rna；

(8)阴性对照：生理盐水。

其中，所述阳性对照中，牛支原体中优选含有10⁴～10⁶拷贝/ml的牛支原体rna。本发明所述试剂盒中的试剂均为本领域中的常规试剂，本发明对试剂来源没有限定，均可市购。

本发明检测牛支原体的试剂盒采用的是rna恒温扩增检测方法，使用m-mlv反转录酶和t7rna多聚酶来同时实现核酸扩增，m-mlv反转录酶用于产生靶标rna的一个dna拷贝，t7rna多聚酶从dna拷贝上产生多个rna拷贝，带有荧光标记的探针与扩增的靶标rna特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测牛支原体中的rna，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物rna在自然环境下易于降解)的特点。

本发明还提供了一种牛支原体的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待检样品中的靶标rna；

(2)利用上述任意一项所述技术方案的引物和探针对待检样品中的菌体的rna进行rna恒温扩增，记录待检样品反应的ct值，根据ct值判定是否含有牛支原体靶标rna。

在本发明中，所述待检样品优选为牛乳，所述牛乳来源没有特殊限定，任意制备或贮藏的牛乳或市售任何品牌的牛乳均可进行检测。本发明优选将待检样品溶解于生理盐水，裂解菌体后，提取菌体的rna做为恒温扩增的模板。本发明所述裂解菌体及提取rna的试剂优选采用本发明上述技术方案所述试剂盒中的试剂进行，所述方法均采用本领域技术人员所熟知的方法。

本发明所述扩增反应可选的在荧光pcr仪中进行，所述反应温度优选为40～44℃，更优选为42℃，反应时间优选为40～60min，更优选为50min。

在本发明中，所述牛支原体的检测方法优选由上述任意一项技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：

(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有靶标rna的裂解溶液；向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标rna结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标rna；

(2)将步骤(1)提取得到的靶标rna加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±0.1℃下温育10min后，再在42℃±0.1℃下温育5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±0.1℃下反应50min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；

(3)根据荧光信号产生的时间和强度，参照mb阳性对照和mb阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有牛支原体活菌，阴性则样品中没有牛支原体活菌。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：用于rna恒温扩增检测牛支原体(mb)的专用引物和探针的设计

本实施例中设计用于rna恒温扩增检测牛支原体(mb)的上游引物mbnt7、下游引物mbt7和mb检测探针。

本发明选择mb细菌高度保守区段16srrnaseqidno：1作为扩增靶序列区域，根据引物和探针设计原理，使用dnaman软件人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测牛支原体(mb)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一对用于在m-mlv反转录酶作用下产生mb靶标核酸(mbrna)的dna拷贝的mb检测引物，所述mb检测引物由上游引物mbnt7和下游引物mbt7组成，上游引物mbnt7引物序列为5’-cttaccaggtgttgacatcc-3’(seqidno：2)，下游引物mbt7引物序列为5’-aatttaatacgactcactatagggagacaacatctcagaacacgagct-3’，(seqidno：3)；

(2)一条用于在t7rna聚合酶作用下根据所述mb靶标核酸(mbrna)的dna拷贝产生的rna拷贝特异结合的mb检测探针mbprobe，所述mb检测探针mbprobe的核苷酸序列为5’-caccgagtgccttcgggaacggtg-3’，(seqidno：4)，5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记。

实施例2：制备牛支原体(mb)的rna恒温扩增检测试剂盒

本实施例制备牛支原体(mb)的rna恒温扩增检测试剂盒。

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明牛支原体(mb)的rna恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有下游mbt7引物、上游mbnt7引物、mb检测探针、m-mlv反转录酶和t7rna聚合酶。

所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述下游mbt7引物、上游mbnt7引物和mb检测探针存在于mb检测液中，所述m-mlv反转录酶和t7rna聚合酶存在于酶液中；具体来讲，试剂盒主要成分如下：

(1)裂解液：10％tritonx-100，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0；

(2)核酸提取液：100mmedta，250mg/l磁珠，30μm捕获探针；所述捕获探针为oligo(dt)，所述oligo(dt)的长度是18；

(3)洗涤液：2mmol/lnacl，5mol/l异硫氰酸胍，10mmol/ltrishcl，ph8.0，10％sds；

(4)mb反应液：10mmol/ltris-hcl，40mmol/lmgcl2，2.5mmdntps，6mmntps，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4；

(5)mb检测液：10pmol/l上游引物mbnt7，10pmol/l下游引物mbt7，8pmol/l荧光探针mbprobe，1mmol/ltris～hclph8.0，0.25mmedta，depc水。

(6)酶液：1000u/反应m-mlv反转录酶、1500u/反应t7rna聚合酶，1mmol/ltris～hclph8.0，2.7mmol/lkcl，1mmol/ledta，10％bsa；

(7)mb阳性对照：含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna；

(8)mb阴性对照：生理盐水。

实施例3：牛支原体的rna恒温扩增检测的灵敏度

本实施例检测牛支原体的rna恒温扩增检测的灵敏度。

用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测牛支原体(mb)，具体方法包括以下步骤：

(1)靶标rna稀释

测定浓度为10⁸拷贝/ml的牛支原体rna，10倍梯度分别稀释到10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml、10²拷贝/ml、10¹拷贝/ml、10⁰拷贝/ml。

(2)核酸提取

在1.5mlep管中加入200μl裂解液、100μl核酸提取液、200μl靶标rna，混匀，60℃温育10分钟，室温放置10分钟。将离心管置于磁珠分离器上，静置5分钟。保持离心管置于磁珠分离器上，吸取液体，保留磁珠；加入1ml洗涤液，震荡混匀后再放回磁珠分离器上，重复洗涤一次，将样品处理管移离磁珠分离器，管中为磁珠-核酸复合物，备用。

(3)恒温扩增检测

向样品处理管中加入40μl反应检测液(40μlmb反应液+2.5μlmb检测液)，mb检测液中下游mbt7引物浓度为10pmol，上游mbnt7引物浓度为10pmol，mb检测探针浓度为5pmol。

取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。

将微量反应管移至天隆tl988pcr仪iv通道(西安天隆公司产品)，42℃反应50分钟，设定每50秒检测一次荧光，共检测60次。本领域技术人员应该理解，fam通道的pcr仪都可以用于完成本实验。

(4)结果判定

根据pcr扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取ct值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。ct表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数；

(1)阳性结果判定：

fam通道：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果fam通道：ct＜60的样本为阳性。

(2)阴性结果判定：fam通道ct无数值或为60。

(5)结果

图1显示灵敏度的检测图，mb菌rna的浓度为10²拷贝/ml，检测结果为阳性，即检测下限灵敏度可以达到10²拷贝/ml，灵敏度高，对低浓度污染的样品有更高的识别度，所以对质控检测来说，本试剂盒更安全更省时。

实施例4：牛支原体的rna恒温扩增检测特异性

本实施例检测牛支原体的rna恒温扩增检测特异性。

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2。

特异性参考样品处理的方法如下：11例阴性参考样品包括沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌o157：h7、普通变形杆菌、柠檬酸杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌。另设一个阳性对照(牛支原体rna)。

检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。

使用本发明试剂盒的检测结果如图3，11个阴性参考品的扩增曲线与阈值线无交叉，可明确判定为阴性。

通过图2可以说明本发明的试剂盒对牛支原体特异性好，能够准确检测出牛支原体，而不会受到其他多种细菌的干扰。

实施例5：实际食品样本的rna恒温扩增检测

本实施例检测实际食品样本的rna恒温扩增。

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3，牛支原体检测食品样本类型包括：牛乳，具体方法包括以下步骤：

(1)食品样本处理：

取检样100ml置灭菌锥形瓶中，加入900ml的生理盐水，充分混匀。牛支原体样本编号为mb食品标本1～5，5号样品为张家口市不同店面的生鲜牛乳，另设阳性对照(含有10⁵拷贝/ml牛支原体rna)、阴性对照(生理盐水)各一个。

(2)核酸提取

具体操作步骤同实施例3。

(3)恒温扩增检测

具体操作步骤同实施例3。

(4)结果判定：

(1)阳性结果判定：

f1通道(fam通道)：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，检测结果f1通道：ct＜60的样本为阳性。

(2)阴性结果判定：f1通道ct无数值或为60则为阴性。

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照f1通道：ct≤55；阴性对照f1通道：ct无数值或为60，否则此次检测结果视为无效。

(5)结果

根据f1通道的ct值情况，判定样本检测均为阴性，见图3，这说明说明本发明的方法可以用于检测市售可得的牛乳是否包含牛支原体。

实施例6：rna恒温扩增检测活菌死菌对比

本实施例对比rna恒温扩增检测活菌和死菌。

本次检测为本发明的另一个应用：试剂盒组成，检测方法及试剂用量同实施例3，具体方法包括如下步骤：

(1)样本处理

取牛支原体检测的靶标rna(10⁸拷贝/ml)，用生理盐水分别稀释到10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml、10²拷贝/ml等梯度，经过121℃水蒸气高压灭菌30分钟，灭菌后在常温放置12小时。

(2)核酸提取

具体操作步骤同实施例3

(3)恒温扩增检测

恒温检测方法同实施例3。

(4)检测结果

对各梯度样本进行检测，本方法可检出10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml，而10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml、10²拷贝/ml均未检出(图4)，实际样本中死菌rna含量低于10⁶拷贝/ml，所以本实验可说明菌体死亡后，其rna也被降解，所以在上述限定浓度只要无活菌本方法就不可检出，可见本发明可区分死活菌，排除出现假阳性的结果，也具有较高的灵敏度。

本专利首用sat方法去检测牛支原体，且本方法实验后可知灵敏度高，特异性好，且菌液rna浓度在10⁶拷贝/ml之下时能区分活死菌，给出了基于rna为模板的一种检测方法，给检测行业又提供了一种新的检测方法和途径。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的牛支原体(mb)rna恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

序列表

<110>张家口健垣科技有限公司

<120>一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法

<130>tqzx2019-zl1606

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