一种甘薯薯瘟病菌的RPA检测引物、试剂盒及检测方法与流程

【技术领域】

本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种甘薯薯瘟病菌的rpa检测引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

由甘薯青枯菌(ralstoniasolanacearum)引起的甘薯薯瘟病是甘薯生产上一种重要的土传细菌性病害，主要分布在我国的南方甘薯产区(福建、广东、广西、台湾)，甘薯薯瘟病能使甘薯减产30-80％，严重时可达100％，全田绝收。在我国，甘薯薯薯瘟别列为检疫性植物病害。近年来甘薯薯瘟病在我国国南方甘薯主产区不断扩大和蔓延，严重威胁甘薯的生产。

甘薯薯瘟病菌对甘薯的侵染过程普遍为从甘薯根茎部伤口或自然孔口侵入，先在皮层、细胞间隙等处定殖，随后在植物导管及附近组织内大量繁殖，并分泌胞外多糖堵塞导管并破坏周围组织，最终使植物萎蔫死亡，典型症状就是植株在萎蔫的状态下依然保持青绿颜色。但是，在发病中后期，甘薯茎秆变为褐色、黑褐色，植株萎蔫，与其他甘薯病害症状类似，如黑腐病、茎腐病等，且植物组织中微生物种类繁多。由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术，发病后盲目大量使用药剂防治引起农药残留，造成食品安全问题，而且防治效果不理想。因此，建立甘薯薯瘟病的早期快速诊断技术，对保障甘薯产业健康生产及食品安全至关重要。

目前检测细菌性病害的方法有血清学检测和聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)方法检测、实时荧光定量pcr方法检测(real-timefluorescencequantitativepcr)、实时荧光定量环介导恒温扩增方法检测(real-timefluorescencequantitativeloopmediatedisothermalamplification)。传统的血清学检测假阳性率较高，pcr和fq-pcr检测方法需要昂贵的专业仪器，且扩增时间较长，价格昂贵，不适合野外及基层单位应用。fq-lamp是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测聚合酶(bstdnapolymerase)在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但lamp在检测过程中产生气溶胶，出现假阳性，且检测时间长。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplificationrpa)被认为是可以替代pcr的核酸检测技术，是英国twistdxinc公司于2006年研发的一种核酸等温扩增技术。近年来rpa广泛应用于很多病原菌的检测。boyle(2014)等在利用rpa技术，开发出一种可以快速、灵敏检测结核分歧杆菌两个目标基因的方法。重组酶聚合酶扩增引物与pcr、lamp引物不同，rpa引物长度在30-40bp，因此引物设计是决定重组酶聚合酶扩增的关键影响因素，rpa引物设计不同于一般的pcr引物设计，引物过长容易产生引物二聚体和发夹结构，引物过短降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度，目前还没有相关软件辅助引物筛选，这给引物筛选带来一定的困难。

鉴于目前生产上还没有特效药防治甘薯薯瘟病，田间一旦发病，很难得到控制，亟需一种能够快速对甘薯薯瘟病进行早期诊断的方法。由于rpa检测技术灵敏、特异、快速(检测时间缩短至20min)不需要特殊仪器等优点，在动植物病原菌检测上得到了广泛的应用。而应用该技术在甘薯薯瘟病菌的检测还未见报道，因此建立甘薯薯瘟病菌rpa快速检测技术在甘薯薯瘟病菌快速诊断具有广泛的应用前景。

rpa与pcr和lamp检测技术比较结果如下表所示：

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种甘薯薯瘟病菌的rpa检测引物，该引物具有准确度高、特异性强、灵敏度高、快速等优点，可快速、准确的检测出甘薯薯瘟病菌。

本发明是这样实现上述技术问题之一的：

一种甘薯薯瘟病菌的rpa检测引物，所述rpa检测引物包括如下一个引物对：

上游引物f：5'-ttaccagttaaagaatgacccaagacatccagtg-3'，如seqidno:1所示；

下游引物r:5'-tcctattacaagagcaatcaaccaacctccaaga-3'，如seqidno:2所示。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种rpa检测甘薯薯瘟菌的试剂盒，该试剂盒可应用于大田甘薯中开展实地快速检测，从而保障甘薯健康生产。

本发明是这样实现上述技术问题之二的：

一种rpa检测甘薯薯瘟菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述rpa检测引物的成套核酸。

进一步地，所述上游引物f、下游引物r的浓度分别为10μm。

进一步地，所述试剂盒还包括twistamp^tmbasickit试剂，所述twistamp^tmbasickit试剂包括无dnase和rnase的h2o、缓冲液、醋酸镁溶液、阳性dna、以及含有冻干酶粉的反应管。

进一步地，所述醋酸镁溶液浓度为280mm；所述冻干重组酶粉由45000nggp32、7500nguxsx和1500nguvsy构成。

进一步地，所述的一种rpa检测甘薯薯瘟菌的试剂盒在检测生产中的甘薯薯瘟病菌的应用。

本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种甘薯薯瘟病菌的rpa快速检测方法，该方法针对甘薯薯瘟病菌建立的rpa等温扩增技术具有扩增特异性好、操作简便、快速、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，对甘薯薯瘟病菌诊断具有广阔应用前景。

本发明是这样实现上述技术问题之三的：

一种甘薯薯瘟病菌的rpa快速检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)、取新鲜采集的薯瘟病害样本，进行甘薯薯瘟病菌病原菌的分离、纯化和培养，得到甘薯薯瘟病菌病原菌的菌液；

步骤(2)、提取步骤(1)所得菌液中的甘薯薯瘟病菌病原菌dna；

步骤(3)、以步骤(2)提取的甘薯薯瘟病菌病原菌dna为模板，采用上述rpa检测引物进行pra恒温扩增反应，或与上述试剂盒中的试剂混合进行pra恒温扩增反应；

步骤(4)、rpa扩增反应结束后，将得到的产物经苯酚/氯仿溶液纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条特异性条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。

进一步地，所述步骤(3)中，rpa恒温扩增反应的反应体系为50μl，其中含模板dna2μl，rehydrationbuffer29.5μl、引物f和r各2.4μl、ddh2o11.2μl、最后再加入280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl，将配好的50μl体系加入的冻干的重组酶粉中。

进一步地，所述步骤(3)中，rpa恒温扩增反应的条件为39℃恒温扩增20min，冰上终止反应。

进一步地，所述步骤(4)具体为：rpa扩增反应结束后向扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μl上清液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现313bp特异性条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。

本发明具有如下优点：

1、结果可靠：本发明所设计出的rpa检测引物，已经对采集分离自不同地点的甘薯薯瘟病菌进行了测试验证，因此对结果可靠性具有充分的保证。

2、特异性强：本发明所采用的rpa引物是针对甘薯薯瘟菌特异基因序列设计了一对扩增引物，利用该引物扩增黄单胞杆菌、芽孢杆菌、晚疫病菌、甘薯黑腐菌、甘薯早疫病菌，均没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。

3、灵敏度高：rpa对甘薯薯瘟病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到1pgμl^-1，具有较高的灵敏度。

4、操作简便：本发明在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备。

5、快速：对甘薯薯瘟病菌进行检测可在20min内完成，对反应产物进行电泳即可实现的检测目的。

总之，本发明针对甘薯薯瘟病菌建立的rpa等温扩增技术具有扩增特异性好、操作简便、快速、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，对甘薯薯瘟病菌诊断具有广阔应用前景。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例1中设计的6对引物的rpa扩增产物电泳图；其中各泳道表示如下，m:dl2000dnamarker，1-2：引物组1；3-4引物爱2；6-7引物组3；9-10：引物组4；11-12：引物组5；13-14：引物组6；5和8为阳性对照；

图2为本发明实施例2中的甘薯薯瘟病特异性检测的rpa扩增产物电泳图；其中各泳道表示如下，m:dl2000dnamarker，1-2：甘薯薯瘟菌，3-9：马铃薯青枯菌、番茄青枯菌、辣椒青枯菌、茄子青枯菌、烟草青枯菌、甘薯黑腐病sx15、甘薯黑腐病sn15，10：h2o。

图3为本发明中实施例3的甘薯薯瘟病灵敏度检测的rpa扩增产物电泳图；其中各泳道表示的甘薯薯瘟病dna浓度如下，m:dl2000dnamarker；1-8分别为10ngμl^-1、1ngμl^-1、100pgμl^-1、10pgμl^-1、1pgμl^-1、100fgμl^-1、10fgμl^-1；1fgμl^-1。

图4为本发明中实施例4的甘薯薯瘟病菌液rpa扩增产物电泳图；其中各泳道表示如下，m:dl2000dnamarker；1-7：甘薯薯瘟菌dna、甘薯薯瘟菌dna、经煮沸的甘薯薯瘟菌液、经煮沸的甘薯薯瘟菌液、未经煮沸的甘薯薯瘟菌菌液、未经煮沸的甘薯薯瘟菌菌液、h2o。

图5a为本发明中实施例5的甘薯薯瘟菌rpa检测试剂盒的应用的rpa扩增产物电泳图；其中各泳道表示如下，m:dl2000dnamarker；1-8：swrs-1、swrs-2、swrs-3、swrs-4、swrs-5、swrs-6、swrs-7、swrs-8；9：h2o。

图5b为本发明中实施例5的甘薯薯瘟菌rpa检测试剂盒的应用的pcr扩增产物电泳图；其中各泳道表示如下，m:dl2000dnamarker；1-8：swrs-1、swrs-2、swrs-3、swrs-4、swrs-5、swrs-6、swrs-7、swrs-8；9：h2o。

【具体实施方式】

实施例1

(1)引物设计与筛选

具体步骤如下：

步骤100：根据甘薯薯瘟菌基因组测序结果的orf428基因序列为靶标基因，设计了6对扩增引物，引物如下。并由福州尚亚生物技术有限公司合成上述引物。

引物组1：

sprsf1:5'-gccaatgcaatcaatcagaagcaagccaatgaa-3'，如seqidno:3所示；

sprsr1:5'-gcctgccgcaccagtaacagcgatcaatgtaacg-3'，如seqidno:4所示；

引物组2：

sprsf2:5'-ttaccagttaaagaatgacccaagacatccag-3'，如seqidno:5所示；

sprsr2:5'-ctattacaagagcaatcaaccaacctccaaga-3'，如seqidno:6所示；

引物组3：

sprsf3:5'-gcaatcaatcagaagcaagccaatgaaagtgca-3'，如seqidno:7所示；

sprsr3:5'-actcctattacaagagcaatcaaccaacctccaa-3'，如seqidno:8所示；

引物组4：

sprsf4:5'-aacaagataactaatgcgattgctgcggttcct-3'，如seqidno:9所示；

sprsr4:5'-tcctctgtttcctttgcactttcattggcttgcttc-3'，如seqidno:10所示；

引物组5：

sprsf5:5'-ttaccagttaaagaatgacccaagacatccagtg-3'，如seqidno:1所示；

sprsr5:5'-tcctattacaagagcaatcaaccaacctccaaga-3'，如seqidno:2所示；

引物组6：

sprsf6:5'-cagacttcaagcctactggacaggcatggtcgt-3'，如seqidno:11所示；

sprsr6:5'-gagcaatcaaccaacctccaagaatacctagcc-3'，如seqidno:12所示。

步骤200：甘薯薯瘟病病原菌的分离、纯化和培养：取新鲜采集的薯瘟病害标本，洗净晾干，室内切片，显微镜下观察有溢菌现象的采用平板划线法进行分离；无菌条件下切取病、健交界处的维管束数块，放在灭菌的载玻片上，滴上几滴无菌水使病组织块完全被浸泡，静置数分钟，用酒精灯烧过的接种环蘸取浸泡液一环在ttc平板上划线，倒置，28℃恒温箱培养24-48h，挑取单菌落于新鲜的ttc平板上划线1-2次，即可得到纯化菌株，保存备用；菌株培养：将保存纯化的菌株活化接种于ttc平板上，置于28℃培养24-48h，挑取单菌落于新鲜nb培养基中，28℃，180r/min，培养16-18h，获得对数生长期的甘薯薯瘟病原菌的菌液，4℃保存备用。

马铃薯青枯菌、番茄青枯菌、辣椒青枯菌、茄子青枯菌、烟草青枯菌、甘薯黑腐病菌菌液保存于本实验室。

步骤300：dna提取：取过夜培养的甘薯薯瘟病原菌的菌液1ml，12000×g离心1分钟，尽量弃上清；加入100μllb11和20μlproteinasek，振荡至菌体彻底悬浮；55℃孵育15分钟直至溶液清亮状，每隔5分钟摇匀一次；加入20μlrnasea混匀静置2分钟；加入400μlbb11涡旋30秒；将全部的溶液加入离心柱中，1000g离心30秒，弃流出液；加入500μlcb11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；加入500μlwb11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；12000×g离心2分钟，彻底除去残留的wb11；将离心柱置于干净的离心管中，在柱中央加入100μl60-70℃预热的eb溶液，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，洗脱dna；稀释dna浓度至50ng/μl，保存于-20℃备用。

步骤400：rpa扩增：以经步骤300处理所得的dna为模板，并以步骤100中获得的6对引物进行rpa恒温扩增反应。

rpa反应的反应体系为50μl，其中含模板dna2μl，rehydrationbuffer29.5μl、引物f和r各2.4μl、ddh2o11.2μl、最后再加入醋酸镁溶液(mgoac，280mmol/l)2.5μl，将配好的50μl体系加入的冻干的重组酶中。

rpa反应的条件为39℃恒温扩增20min，冰上终止反应。

步骤500：rpa恒温扩增反应得到的产物经50μl苯酚/氯仿(1∶1)溶液纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中引物组1、2和6没有扩充出特异性条带，引物组3扩增出条带，但是引物组3扩增出梯形条带，不能用于后续的实验，引物组4和5扩增出条带，条带经测序比对后发现引物组4扩增出的条带为非特异条带，而引物组5扩增的条带为特异性条带。所以选用引物组5进行后续实验。

实施例2

分别以用甘薯薯瘟菌、马铃薯青枯菌、番茄青枯菌、辣椒青枯菌、茄子青枯菌、烟草青枯菌、甘薯黑腐病sx15、甘薯黑腐病sn15的dna作为模板加入与实施例1相同的反应体系，利用实施例1筛选出的引物组5进行rpa检测，充分混匀后39℃扩增20min，反应结束后得到的产物经50μl苯酚/氯仿(1∶1)溶液纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，具体实验结果如图2所示，从图2中可知，只有甘薯薯瘟病菌菌检测结果有特异性条带，其他样品不产生特异条带，说明发明的rpa检测方法对甘薯薯瘟病菌菌的检测具有很强的特异性。

实施例3

为了考察本发明甘薯薯瘟病菌的rpa检测方法的灵敏度，发明人对模板dna样品采用10倍浓度系列稀释法将提取的病原菌dna稀释成浓度分别为10ngμl^-1、1ngμl^-1、100pgμl^-1、10pgμl^-1、1pgμl^-1、100fgμl^-1、10fgμl^-1；1fgμl^-1；共8个不同浓度梯度。利用实施例1筛选出的引物组5进行rpa检测，充分混匀后39℃扩增20min，反应结束后得到的产物经50μl苯酚/氯仿(1∶1)溶液纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图3所示，从图3中可知：甘薯薯瘟病菌菌rpa灵敏性检测，琼脂糖凝胶电泳出现rpa特征性带，检测灵敏度可达1pgμl^-1，具有很高的灵敏度。

实施例4

为了考察本发明rpa检测方法直接检测甘薯薯瘟菌菌液的可行性，省去核酸提取的复杂过程，发明人对实施例1步骤200中甘薯薯瘟菌菌液进行了以下rpa扩增：1、菌液经沸水浴后为模板进行rpa扩增；2、菌液直接作为模板进行rpa扩增。利用实施例1筛选出的引物组5进行rpa检测，充分混匀后39℃扩增20min，反应结束后得到的产物经50μl苯酚/氯仿(1∶1)溶液纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图4所示，从图4中可知：以甘薯薯瘟病菌dna为模板能够扩增出特异条带，以甘薯薯瘟病菌菌液水浴后为模板能扩增出特异性条带，而直接以甘薯薯瘟病菌菌液为模板的未扩增出特异性条带。说明建立的rpa方法能实现水浴后的薯瘟病菌液的检测，省去核酸提取的复杂过程，大大缩短了检测时间。

实施例5

为了考察本发明rpa检测试剂盒及方法的应用，发明人对田间采集的不同地点的甘薯薯瘟菌进行了验证。以福建福州(编号为swrs-1、swrs-2的两个甘薯薯瘟病样)、福建福鼎(编号为swrs-3、swrs-4的两个甘薯薯瘟病样)、福建三明(编号为swrs-5、swrs-6的两个甘薯薯瘟病样)、福建泉州(编号为swrs-7的甘薯薯瘟病样)、福建连城(编号为swrs-8的甘薯薯瘟病样)8个甘薯薯瘟病样为模板。利用实施例1筛选出的引物进行rpa检测，充分混匀后39℃扩增20min，反应结束后得到的产物经50μl苯酚/氯仿(1∶1)溶液纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5a所示；同时以8个甘薯薯瘟病样为模板，进行pcr扩增，并将pcr扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5b所示；从图5a和5b中可知，采集福建福州、福鼎、三明、泉州和连城甘薯薯瘟病菌均为阳性，和pcr鉴定结果一致，说明发明的甘薯薯瘟病菌rpa检测试剂盒检测准确度高，能够很好的应用于田间样品的检测。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110>福建省农业科学院作物研究所

<120>一种甘薯薯瘟病菌的rpa检测引物、试剂盒及检测方法

<130>100

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

ttaccagttaaagaatgacccaagacatccagtg34

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>2

tcctattacaagagcaatcaaccaacctccaaga34

<210>3

<211>33

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>3

gccaatgcaatcaatcagaagcaagccaatgaa33

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>4

gcctgccgcaccagtaacagcgatcaatgtaacg34

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<211>32

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>5

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<211>32

<212>dna

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<400>6

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<212>dna

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<400>8

actcctattacaagagcaatcaaccaacctccaa34

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<211>33

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cagacttcaagcctactggacaggcatggtcgt33

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<211>33

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>12

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