一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒。

背景技术：

鸡白痢病(pd)是由鸡白痢沙门菌造成是一种严重的系统性疾病，可进行垂直传播，主要感染小鸡，影响生殖能力并且造成很高的死亡率，母鸡被感染产蛋量严重下降。

在西方发达国家该病已被消灭或基本消灭，偶尔在个别小的禽群中仍有发生，但在包括我国在内发展中国家中仍然是重要的传染病，造成很大的经济损失。鸡白痢沙门菌的早期快速检测鉴别是该病防控和净化的基础。传统的分离鉴定方法周期长，流程多。同时鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌都属于沙门菌d血清群，在临床症状上往往相似很难区分，而玻片凝集试验容易产生非特异性反应并且缺乏敏感性，往往发生误判。在目前国内养殖场提倡净化鸡白痢的大环境下，亟需发明一种高效、特异、敏感的鸡白痢沙门菌快速检测试剂盒供一线使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒，具有准确快速检出鸡白痢沙门菌的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组，包括以下引物：

fip：

5′-tagcaagcaatagtgttacgacagaaaataattggatcga-3′；

bip：

5′-tgcaacagctttaatactgcatcaagtgatgagatagac(rna碱基)tctac-c3spacer-3′；

f3：5′-aggaacaatgaagctaccata-3′；

b3：5′-ggcagtgatgttccacaat-3′；

loopb：5′-gcaatattcttatgcctatcagagt-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

基于上述的快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括loopb、f3、b3、fip和bip；

fip：

5′-tagcaagcaatagtgttacgacagaaaataattggatcga-3′；

bip：

5′-tgcaacagctttaatactgcatcaagtgatgagatagac(rna碱基)tctac-c3spacer-3′；

f3：5′-aggaacaatgaagctaccata-3′；

b3：5′-ggcagtgatgttccacaat-3′；

loopb：5′-gcaatattcttatgcctatcagagt-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

进一步的，反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dntp2μl、bst酶1.0μl、rnasehⅱ酶0.1μl、fip+bip3μl、f3+b30.5μl、loopb1μl和evagreen1μl。

本发明的有益效果为：

1、鸡白痢沙门菌rfbs基因是一个具有单核苷酸多态性(snp)的特定dna序列。在第237位点鸡白痢沙门菌为鸟嘌呤，而鸡伤寒沙门菌和鸡肠炎沙门菌等为腺嘌呤，别的一些血清型和别的种类的菌株不含有该基因或者变化较大。本发明根据鸡白痢沙门菌在第237位点的单核苷酸多态性，设计了基于单核苷酸互补激活酶切割的等温扩增引物组和实验方法，用于组装成试剂盒。其原理是：靶向鸡白痢rfbs基因，在一侧内引物上设计与第237位点dna碱基互补的rna碱基，当两者互补结合时，激活rnasehⅱ酶发生切割，阻断失效，目的基因继续扩增。当两者不互补时，阻断仍然有效，该内引物介导的扩增无法继续完成，从而实现特异性检测鸡白痢沙门菌的目的

2、本发明的引物组，具有灵敏度高的特点，60min内即可完成检出。

3、本发明的引物组特异性强，能很好的从22种沙门菌和9种其他致病菌中准确检出，检测下限为21个拷贝数，敏感性极强。

附图说明

图1是本发明基于单核苷酸互补激活酶切割的等温扩增引物组实验方法的原理图；

图2是基础反应体系扩增结果图；

图3是特异性评价实验结果图；

图4是敏感性评价实验结果图；

图5是临床分离样本鉴定的结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

实施例1快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组

本实施例的引物组，包括：

fip：

5′-tagcaagcaatagtgttacgacagaaaataattggatcga-3′；

bip：

5′-tgcaacagctttaatactgcatcaagtgatgagatagac(rna碱基)tctac-c3spacer-3′；

f3：5′-aggaacaatgaagctaccata-3′；

b3：5′-ggcagtgatgttccacaat-3′；

loopb：5′-gcaatattcttatgcctatcagagt-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

采用上述引物组检测snp的方法，包括以下步骤：

(1)提取dna为待检测模板；

(2)设计引物组，引物组中的引物具有与dna突变位点相结合的rna碱基；

(3)建立反应体系，反应体系中包含rnasehⅱ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当引物与dna突变位点相结合时，激活rnasehⅱ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当引物与dna突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；

(4)判断反应物中是否具有目标dna。

实施例2基于实施例1引物组的试剂盒

本实施例的试剂盒，包括反应液，反应液包括loopb、f3、b3、fip和bip；

fip：

5′-tagcaagcaatagtgttacgacagaaaataattggatcga-3′；

bip：

5′-tgcaacagctttaatactgcatcaagtgatgagatagac(rna碱基)tctac-c3spacer-3′；

f3：5′-aggaacaatgaagctaccata-3′；

b3：5′-ggcagtgatgttccacaat-3′；

loopb：5′-gcaatattcttatgcctatcagagt-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dntp2μl、bst酶1.0μl、rnasehⅱ酶0.1μl、fip+bip3μl、f3+b30.5μl、loopb1μl和evagreen1μl。

以检测鸡白痢沙门菌为例，验证本发明快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒的可靠性。

1、材料和方法

1.1菌株

鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等，包括标准菌和由华南农业大学兽医学院人兽共患病防治重点实验室鉴定保存菌株。

1.2主要试剂

lb肉汤、lb琼脂、xlt4琼脂基础、缓冲蛋白胨水溶液(bpw)、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(ttb)、脑心浸出液肉汤(bhi)等购自广东环凯微生物科技有限公司；bst酶、硫酸镁、buffer等(新英格兰生物实验室公司)；rnasehⅱ酶(integrateddnatechnologies)；dntp(北京全式金生物技术有限公司)；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；超纯水由elix100纯净水装置制备(美国millipore公司)。

1.3实验

1.3.11.3.1提取细菌基因组dna

采用热裂解法制备各细菌基因组dna模板，用于下述的特异性评价实验和敏感度实验评价。

dna模板包括鸡白痢沙门菌(2株)、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌共32株。

1.3.2构建标准质粒

根据鸡白痢沙门菌rfbs基因登录号：genbank:lk931482.1，鸡伤寒沙门菌rfbs基因登录号：af442573，在两种菌的rfbs基因两侧设计pcr引物。rfbsf:aatatcaccatgtacaaactcaaag，rfbsr:atcgtgtagtgggtgagt。用pcr方法扩增出鸡白痢沙门菌和及鸡伤寒沙门菌rfbs基因的全长。

扩增出的产物经电泳实验验证后采用商业化试剂盒(品牌omega)进行胶回收，过夜连接t载体，将连接产物转化入dh5α感受态细胞，将该感受态细胞进行扩大培养，提取dna进行电泳测试和进行测序验证，同时按商业化试剂盒说明提取质粒。用分光光度计测定质粒浓度并换算成拷贝数，然后-20℃保存待用。

1.3.3引物设计

针对鸡白痢沙门菌rfbs基因，设计反应引物如下：

1.3.4基础反应体系的建立和优化

使用构建好的鸡白痢沙门菌标准质粒，鸡伤寒沙门菌标准质粒，设置荧光采集为1循环/min，共60个循环，调整试剂各组分比例，建立基础反应体系，反应温度定为61℃。

基础反应体系如下：25μl体系，其中buffer：2.5μl，硫酸镁：2.0μl，dntp：2μl，bst酶：1.0μl，rnasehⅱ酶0.1μl，fip+bip：3μl，f3+b3：0.5μl，loopb：1μl，evagreen(荧光染料)：1μl，菌模板2.5μl，超纯水补齐。

基础反应体系反应原理如图1所示。基础反应体系扩增结果如图2所示，鸡白痢沙门菌反应的实时荧光曲线在21.44分钟左右开始显著增长，呈现“s”型增长曲线(曲线ⅰ)，表明鸡白痢沙门菌标准质粒的存在成功地引发了pa-lamp反应。相比之下，存在鸡伤寒沙门菌标准质粒的目标反应产生的荧光信号在34.05分钟左右才开始增长(曲线ⅱ)，比鸡白痢突变模板晚了13分钟左右，这是由于错配的存在无法激活rnasehⅱ酶对rna碱基进行有效切割，降低了lamp反应的效率。结果表明，鸡白痢突变模板的存在是其反应速率较快的直接原因，二者之间13分钟左右的差值足可以用来对snp进行区分，实验结果验证原理可行，基础反应体系成功建立。图2中，ⅰ线表示鸡白痢沙门菌标准质粒的扩增，ⅱ线表示鸡伤寒沙门菌标准质粒的扩增，ⅲ线为阴性对照。

1.3.5特异性评价

使用1.3.1提取的32株细菌基因组dna模板，采用1.3.4建立的反应体系和反应温度，进行特异性评价实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度。结果如图3所示，其中，a-b线表示鸡白痢沙门菌的扩增，c线表示鸡肠炎沙门菌的扩增，d线表示鸡伤寒沙门菌的扩增，e线表示其他血清型沙门菌和其他种菌株、阴性对照。由图3可知，鸡白痢沙门菌明显先于鸡伤寒沙门菌和鸡肠炎沙门菌完成扩增，区分度大，其他血清型沙门菌和其他种菌株均不扩增，本发明能特异性地检出鸡白痢沙门菌。

1.3.6敏感性评价实验

经计算，1.3.2构建的鸡白痢沙门菌质粒原液拷贝数为2.1×10¹⁰拷贝，采用10^-4—10^-10稀释度质粒用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度。敏感性评价的结果如图4所示。图4中，a线为2.1×10⁶拷贝数扩增曲线，b线为2.1×10⁵拷贝数扩增曲线，c线为2.10×10⁴拷贝数扩增曲线，d线为2100拷贝数扩增曲线，e线为210拷贝数，f线为21拷贝数扩增曲线，g线为2.1拷贝和阴性对照扩增曲线。本发明检测下限为21个拷贝数，敏感性好。

1.3.7临床分离样本鉴定

临床分离出30株鸡白痢沙门菌，分别提取dna模板，用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度，结果如图5所示，显示株鸡白痢沙门菌在60min内全部被快速检出。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒

<160>5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tagcaagcaatagtgttacgacagaaaataattggatcga40

<210>2

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgcaacagctttaatactgcatcaagtgatgagatagactctac44

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aggaacaatgaagctaccata21

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggcagtgatgttccacaat19

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>

gcaatattcttatgcctatcagagt25