小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性检测分子标签3283、3316及其快速检测方法与流程

本发明属于小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因检测技术领域，具体涉及两个小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性检测分子标签3283、3316及其快速检测方法。

背景技术：

核酸扩增检测方法(nucleicacidamplificationtest,naat)是近年来逐渐兴起的一种检测食品和临床环境中致病菌的快速、易用、灵敏、经济和人工成本低的检测方法。基于此方法设计的胃肠多重检测板(gastrointestinalmultiplexpanel,gimp)也越来越多的应用于临床检测中。

小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica，ye)是一种广泛存在于世界范围内的革兰氏阴性致病菌，可引起人畜共患的耶尔森氏病。处理或食用未经煮熟的猪肉是导致人类患病的主要原因。患有耶尔森氏病的患者通常表现为发烧、腹痛和腹泻组成的临床综合征；急性耶尔森氏病可能引起严重的并发症如败血症，此类症状容易出现于免疫力低下的宿主如婴儿和接受免疫抑制治疗的患者。耶尔森氏病由于其致病菌分布范围广，往往患病人数较多，据欧盟近年来报道，耶尔森氏病的患病人数多年位居人畜共患病的第三位。而美国疾病控制和预防中心(cdc)运营的食源性疾病主动监测网络(foodnet)的监测数据显示，过去四年间(2015-2018)小肠结肠炎耶尔森氏菌感染引起的耶尔森氏病的发病率一直在逐渐增加(2015年139例，2016年302例，2017年489例，2019年465例)。因此，及时检测出食品中(特别是肉制品)小肠结肠炎耶尔森氏菌的污染情况，并防止受污染食品流入市场是降低耶尔森氏病发病率的重要手段。

相比于其他常见的食源性致病菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌具有生长缓慢和耐冷能力强的特点，因此该菌的分离鉴定往往采用冷富集的方法进行预处理。这就造成了小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离鉴定周期往往很长(7-10天)，并且检出率较低。检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的时间和人力成本高造成很难及时检测出食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌污染。近年来，随着基因组学技术的不断发展，越来越多的特异性分子标签被挖掘出来，并被应用于特异菌株的检测中。iso(iso10273:2017)最新修订的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测中就引入了pcr扩增毒力基因ail的方法来替代传统生化鉴定，减少检测成本，缩短检测时间，从而使得实时监控成为可能。与此同时，美国cdc也开始使用gimp来检测胃肠道病原菌，有数据显示，gimp在美国实验室的使用率由<1％(2013年，2/460)增加至14％(2016年，59/421)。

相比于传统的培养法及生化鉴定，pcr检测具有以下优点：(1)经济性合理，pcr检测成本低，可以节约大量的人力物力；(2)具有高通量潜力，pcr由于可以大批量进行，并且可以与微流控芯片等新检测技术相结合因此具有进行高通量检测的潜力；(3)时效性强，pcr检测可以快速获得检测结果，因此可以用于食品安全监测或疑似病例确诊。因此，小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性分子标签的挖掘对于此后小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测方法的开发以及食品监测网络的完善具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子检测的分子标签多为毒力基因，而没有针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的种属特异性的分子检测分子标签的现状，比对搜索获得了两个小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性的分子标签3283和3316，并针对这两个分子标签设计了其专用的pcr检测引物，用于其特异性检测。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一组小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性检测分子标签3283或/和3316，所述分子标签为dna片段，所述分子标签3283编码如氨基酸序列如seqidno.3所示的蛋白；所述分子标签3316编码如氨基酸序列如seqidno.4所示的蛋白。

优选地，所述分子标签3283具有如(a)或(b)所示的核苷酸序列：

(a)如seqidno:1所示的核苷酸序列；

(b)具有与seqidno:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且编码氨基酸序列如seqidno.3所示的蛋白。

优选地，所述分子标签3316具有如(c)或(d)所示的核苷酸序列：

(c)如seqidno:2所示的核苷酸序列；

(d)具有与seqidno:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且编码氨基酸序列如seqidno.4所示的蛋白。

本发明还提供了所述分子标签3283或/和3316在制备检测小肠结肠炎耶尔森氏菌试剂中的应用。

本发明还提供一组检测所述分子标签3283或/和3316的引物，检测所述分子标签3283的上游引物其核苷酸序列如seqidno:5所示，下游引物其核苷酸序列如seqidno:6所示；检测所述分子标签3316的上游引物其核苷酸序列如seqidno:7所示，下游引物其核苷酸序列如seqidno:8所示。

本发明还提供一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌试剂盒，包括如seqidno:5～8所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测微生物的dna，以提取的dna为模板，采用本发明特异性引物对其进行pcr扩增；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小约350bp(3283标签)或279bp(3316标签)的条带则判定样品中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有小肠结肠炎耶尔森氏菌。

pcr扩增采用25μl反应体系包括：10×pcr反应缓冲液2.5μl、25mmol/l的mgcl22.0μl、10mmol/l(each)的dntps0.5μl、10μmol/l引物0.5μl、taq酶1u、dna模板0.5-1μl、灭菌双蒸水补足体积至25μl。

优选地，所述3283分子标签的pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环，72℃延伸5min。

优选地，所述3316分子标签的pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸5min。

与现有技术相比本发明的具有以下有益效果：

(1)本发明基于小肠结肠炎耶尔森氏菌的全基因组测序信息，通过泛基因组分析挖掘出小肠结肠炎耶尔森氏菌的种属特异性分子标签，并采用pcr扩增技术进行验证，结果准确可靠。

(2)本发明公开的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的pcr方法可同时检测小肠结肠炎耶尔森氏菌多个特异性分子标签，比以往的生化鉴定方法可以节省大量人力物力，并且可以简化实验流程，排除大量假阳性结果，为高通量检测食品等样品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌污染情况提供了可能。

(3)本发明采用的pcr方法结果分析只需要进行琼脂糖凝胶电泳即可准确得知样品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌污染情况，无需进行dna序列测定等后续步骤，降低了dna序列测定带来的时间和经济成本，并减少了dna序列测定误差对结果可信度的影响。

(4)当前小肠结肠炎耶尔森氏菌检测所用的分子标签多为毒力因子，而针对小肠结肠炎耶尔森氏菌种属的特异性分子标签则很少报道，本发明寻找并确定了两个小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性分子标签，可以作为新的检测分子标签填补此前小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性分子检测分子标签的空缺。

附图说明

图1为使用23株小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组dna为模板，进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分子标签3283存在情况的检测结果示意图(图中1-23号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；24号样品为空白对照；目标条带大小为358bp，图中可明显看出1～23有明显条带)。

图2为使用23株小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组dna为模板，进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分子标签3316存在情况的检测结果示意图(图中1-23号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；24号样品为空白对照；目标条带大小为279bp，图中可明显看出1～23有明显条带)。

图3为小肠结肠炎耶尔森氏菌检测分子标签3283在32株蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌等非耶尔森氏属的常见致病菌中特异性检验结果示意图(图中1-32号样品为耶尔森氏菌属外其他致病菌；33号样品为空白对照；34号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；目标条带大小为358bp，图从1～32号没有条带，34号条带明显)。

图4为小肠结肠炎耶尔森氏菌检测分子标签3316在32株蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌等非耶尔森氏属的常见致病菌中特异性检验结果示意图(图中1-32号样品为耶尔森氏菌属外其他致病菌；33号样品为空白对照；34号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；目标条带大小为279bp，图从1～32号没有条带，34号条带明显)。

图5为小肠结肠炎耶尔森氏菌检测分子标签3283在37株中间耶尔森、弗氏耶尔森、鲁氏耶尔森、伯氏耶尔森氏菌等耶尔森氏属菌株中特异性检验结果示意图(图中1-37号样品为弗氏、中间、鲁氏、伯氏耶尔森氏菌；38号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；39号样品为空白对照；目标条带大小为358bp，图中1～37号没有条带，38号条带明显)。

图6为小肠结肠炎耶尔森氏菌检测分子标签3316在37株中间耶尔森、弗氏耶尔森、鲁氏耶尔森、伯氏耶尔森氏菌等耶尔森氏属菌株中特异性检验结果示意图(图中1-37号样品为弗氏、中间、鲁氏、伯氏耶尔森氏菌；38号样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌；39号样品为空白对照；目标条带大小为279bp，图中1～37号没有条带，38号条带明显)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性分子标签的查找

小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性分子标签的筛选主要基于泛基因组分析结果。共选取16株小肠结肠炎耶尔森氏菌的全基因组完成图数据(来自ncbi数据库)、23株小肠结肠炎耶尔森氏菌的全基因组草图数据(菌株为本实验保存菌株并在本实验室完成测序)以及78株其他耶尔森氏菌的全基因组数据进行泛基因组分析(除小肠结肠炎耶尔森氏菌种外的耶尔森氏菌，种类及数量见表1)。泛基因组分析采用原核生物泛基因组自动化分析软件(pan-genomicsanalysispipeline，pgap)中的mp方法，通过本地perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因以及非核心基因信息。而后选取小肠结肠炎耶尔森氏菌所特有的基因，通过本地blast比对剔除非特异性序列，并经pcr扩增验证后得到最终的小肠结肠炎耶尔森氏菌种特异性分子标签3283(seqidno:1)和3316(seqidno:2)，所述分子标签3283编码的蛋白核苷酸序列如seqidno:3所示，所述分子标签3316编码的蛋白核苷酸序列如seqidno:4所示。

表1：泛基因组分析所用菌株种类及数量

实施例2小肠结肠炎耶尔森氏菌分子靶标快速检测方法的建立

根据序列分子标签3283(seqidno:1)和3316(seqidno:2)设计特异性扩增引物，引物序列如表2：

表2：标签3283和3316引物序列

以本实验室从食品中分离得到的23株小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组dna为模板进行pcr扩增验证。

pcr体系为25μl，其中包括10×pcr反应缓冲液2.5μl、25mmol/l的mgcl22.0μl、10mmol/l(each)的dntps0.5μl、10μmol/l引物0.5μl、taq酶1u、dna模板0.5-1μl、灭菌双蒸水补足体积至25μl。

3283分子标签的pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸5min。3316分子标签的pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸5min。

使用琼脂糖凝胶电泳(所用琼脂糖凝胶的琼脂糖浓度为1.0％)进行pcr结果的检测，若电泳结果出现358bp(3283分子标签，图1)或/和279bp(3316分子标签，图2)大小条带则认为该菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌(或样品中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌)。若未出现条带或无正确大小的条带则说明该菌株不为小肠结肠炎耶尔森氏菌(或样品中不含有小肠结肠炎耶尔森氏菌)。检测结果如表3(图1、2)：

表3：23株小肠结肠炎耶尔森氏菌分子靶标3283和3316检测方法建立实验结果。

注：表中“—”表示pcr扩增结果为阴性，“+”表示pcr扩增结果为阳性。

实施例3小肠结肠炎耶尔森氏菌pcr检测方法的特异性评估结果

取37株中间耶尔森、弗氏耶尔森、鲁氏耶尔森、伯氏耶尔森氏菌等非小肠结肠炎耶尔森氏菌的耶尔森氏属菌株、32株蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌等非耶尔森氏属菌株进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分子标签3283和3316的特异性检验。提取上述相应菌株的基因组dna为模板按照实施例1所述的pcr扩增体系及扩增条件进行pcr扩增，最终通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测结果如表4，表5所示(对应的电泳结果图片分别为图3、4和图5、6)。

表4：分子标签3283和3316在32株蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌等非耶尔森氏属的常见致病菌中的特异性检验结果

注：表中“—”表示pcr扩增结果为阴性，“+”表示pcr扩增结果为阳性。

表5：分子标签3283和3316在37株中间耶尔森、弗氏耶尔森、鲁氏耶尔森、伯氏耶尔森氏菌等耶尔森氏属菌株中的特异性检验的结果

注：表中“—”表示pcr扩增结果为阴性，“+”表示pcr扩增结果为阳性。

综上，本发明的分子标签3283和3316对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有特异性，在常见治病菌种中以及耶尔森氏菌属中非小肠结肠炎耶尔森氏菌均检测不出该分子标签，因此，分子标签3283和3316可作为专门针对检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异标签。扩增这两种分子标签的引物可形成检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

sequencelisting

<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），广东环凯生物科技有限公司，广东环凯生物技术有限公司

<120>小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性检测分子标签3283、3316及其专用检测引物

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