解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用。

背景技术：

解脲脲原体(m.urealyticum，uu)是介于细菌与病毒之间的最小原核生物，无细胞壁，能利用自身尿素酶分解尿素以提供代谢能源。根据其表型、遗传和分子生物学特征，14个标准血清型可分为两个生物群：生物1群包括1、3、6、14共4个血清型；生物2群为其余10个血清型。致病菌以血清型1、3、6、14型为主，主要寄居于人体的泌尿生殖道。与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症有密切联系。男性泌尿生殖道解脲脲原体菌群的寄生率约为25％，女性泌尿生殖道解脲脲原体菌群的寄生率约为0-80％。解脲脲原体可引起患者非淋菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎、不孕不育症等危害；孕妇感染，可危害母体健康、胎儿生存。解脲脲原体可存在于健康无症状的个体中，是一种条件致病微生物，在特定的环境下可以致病，其致病性与多种因素有关，如宿主免疫力、病原血清型或基因型等。

目前实验室常用的诊断uu感染的方法有很多，一般可以分为uu分离培养、免疫学方法和分子生物学诊断三种。uu分离培养是最传统的检测方法，需接种液体培养后再接种至固体培养基证实后镜检，该方法要求苛刻、阳性率低、耗时较长(约一周)，无法在临床上有效应用。免疫学方法主要有elisa、胶体金免疫层析法等，优点是操作简单、特异性强；缺点是敏感度低、且泌尿生殖道病原体感染性疾病产生的抗体检测存在窗口期，在病原体感染初期不易检测到。分子生物学技术包括核酸杂交、分离、聚合酶链反应(pcr)、基因芯片技术、悬浮阵列技术等，它们普遍灵敏度高、特异性强、速度较快、甚至能高通量检测，但也常常遇到一些问题，如单一检测一种病原体，费时、费力、检测成本高，而多种病原体pcr检测效率不高；扩增产物dna污染导致假阳性，且dna非常稳定难以消除；实时pcr技术需要昂贵的荧光探针以及昂贵的检测仪器，检测成本高。因此，继续寻找一种操作简单、快速、低廉的uu病原体诊断方法是必要的。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和t7rna聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的rna产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成rna扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在nc膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的rna提取过程，也不需要特殊的仪器，基于rna分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使解脲脲原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于rna恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1)扩增反应液：含40mmtris-hcl(ph8.0)，12mmmgcl2，70mmkcl，15％dmso，5mmdtt，每种dntp各1mm，每种ntp各2mm，扩增引物各0.2μm。其中扩增引物包括两对：解脲脲原体和人内参基因，具体如下：

(1)uu(多带抗原基因mba序列)的扩增引物：

uu-r引物(5’-3’)：taatacgactcactatagggagatttggttcacgwggtaatt；

uu-f引物(5’-3’)：gtatttgcaatctttatatgttttcg；

注：本发明中的简并碱基w代表a/t。

(2)内参基因(人18srrna一段保守区序列)的扩增引物：

内参-r引物(5’-3’)：taatacgactcactatagggagacaccagacttgccctcca；

内参-f引物(5’-3’)：agaaacggctaccacatcc；

由于uu的mba基因序列变异较大，在设计引物时必须保证能够扩增出所有血清型株的核酸，本发明在设计uu扩增引物时r引物设计成简并碱基，对uu的14个血清型进行了全覆盖。在设计引物时同时也保证了各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。两对引物的r引物5’端都引入了t7rna聚合酶启动子序列。

2)扩增酶：由三种酶混合而成，包括逆转录酶(如amv或m-mlv)、t7rna聚合酶和rnaseh；

3)细胞裂解液(购自美国signosis公司，货号cl-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；

4)检测液：含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、c线显色探针。每个指标特异探针有两种，分别为ces系列和les系列，其中ces系列和les系列又可以设计多条，这样可与目的核酸片段不同部位杂交结合，增加检测的特异性与灵敏性；

具体如下：

(1)uu的特异探针，

uu-ces1(5’-3’)：gttttcgttaaaattaaaatttttatctatagctggtgt；

uu-ces2(5’-3’)：ataaatgaaattattaaaaaataatttttatctatagctggtgt；

uu-les1(5’-3’)：tgaaaayaaaacagaaattttcgcagtgctcgagctctgagc；

注：本发明中的简并碱基y代表t/c。

uu-les2(5’-3’)：gtttacgamattgaaaattttcgcagtgctcgagctctgagc；

uu-les3(5’-3’)：tgcamttacatcagytgaaaattttcgcagtgctcgagctctgagc；

注：本发明中的简并碱基m代表a/c，y代表t/c。

(2)内参特异探针

内参ces1(5’-3’)：aaggaaggcagcaggcttttatctgtatagtgtctg；

内参ces2(5’-3’)：gcgcaaattacccactttttatctgtatagtgtctg；

内参les1(5’-3’)：cccgacccggggaggtttttcgcagtgctcgagctctgagc；

内参les2(5’-3’)：agtgacgaaaaataacttttcgcagtgctcgagctctgagc；

内参les3(5’-3’)：aatacaggactctttcttttccgcagtgctcgagctctgagc；

(3)c线显色探针(5’-3’)

tcagatcactatgtacttttcgcagtgctcgagctctgagc；

(4)金探针

金探针5’端被巯基化修饰，序列为(5’-3’)：

cctactctgcagtgctccatcgtacgtctgtcatttttgctcagagctcgagcactgcg；

5)试纸条：所用试纸条被固定于pvc底板上，从下往上依次是样品垫、nc膜、吸水纸。nc膜上检测线有三条，从样品垫到吸水纸方向分别为uu-t线、内参-t线和c线(质控线)(图3)；uu-t线处固定uu包被探针、内参-t线处固定内参包被探针、质控-c线处固定质控包被探针，具体序列(5’-3’)为：

uu包被探针：acaccagctatagatattttacaccagctatagata；

内参包被探针：cagacactatacagatttttcagacactatacagat；

c线包被探针：gtacatagtgatctgattttgtacatagtgatctga。

本发明提供利用上述基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测解脲脲原体核酸的试剂盒检测解脲脲原体核酸的方法，包括如下步骤：

(1)rna恒温扩增

本发明在同一扩增管内实现同时对uu和人内参基因这两个指标的扩增。针对每个指标设计一对(f/r引物)扩增引物，其中每个r引物5’端都引入t7rna聚合酶启动子序列。扩增时，在带有t7启动子序列的r引物和逆转录酶的作用下，以待测rna目的区域为模版，逆转录形成rna-cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna-cdna杂合体中的rna，得到单链cdna；在f引物和反转录酶的dna聚合酶功能的作用下，以单链cdna为模版合成第二链，形成带有t7启动子的双链dna；带有t7启动子的双链dna在t7rna聚合酶的作用下转录生成rna分子产物。转录的rna分子产物可以进入循环扩增过程，首先f引物会结合转录的rna分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；接着r引物会结合到单链cdna上，在反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有t7启动子的双链dna分子，为t7rna聚合酶提供更多的转录模板，进而在t7rna聚合酶的作用下转录生成大量的rna分子产物(图1)。

本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时，样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时就会被检测到。uu检测结果为阴性时内参应该为阳性，否则需要重新采样重测。

(2)金探针层析

a，设计特异探针、金探针、c线显色探针和包被探针

特异探针：每个指标特异探针包括ces系列和les系列两种，每种探针可以设计多条。其中，ces探针的两端可分别与目的基因扩增产物、nc膜上的包被探针结合，起到固定扩增产物rna的作用，这两个部分用4～5个t链接；les探针的两端可以分别与目的基因扩增产物、金探针结合，起到富集胶体金在检测线处显色的作用，这两个部分用4～5个t链接。

金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，从而标记上胶体金颗粒。金探针的3’端可与特异探针les的一端结合。

包被探针：包被探针被固定在nc膜上，可以和特异探针ces的一端结合，起到固定的作用。每条包被探针含有两个拷贝，每个拷贝之间用4～5个t链接。

c线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个t链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在nc膜上的c线包被探针结合。在层析时，无论有无rna扩增产物，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被nc膜上的c线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。

所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，ces系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。

所述特异探针的ces系列和les系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。

b，试纸条检测

所用试纸条有检测线和质控线，包括在uu-t线、内参-t线、质控-c线，其中uu-t线处的包被探针能够特异性结合uu-ces系列探针的一端；内参-t线处的内参包被探针能够特异性结合内参ces系列探针的一端。质控-c线处的包被探针能特异性结合c线显色探针。

将特异探针ces、特异探针les、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效(如图2)。

结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

(1)样本采集

采集疑似患者的生殖道拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病原体。

(2)rna恒温扩增

向17μl的含有uu和内参引物的扩增反应液中加入2μl裂解提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟。加入1μl扩增酶，42℃恒温扩增45分钟。待测样本中若有uu，指标rna分子即会得到大量扩增富集。

(3)试纸条层析

a，预杂交

将rna恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及c线显色探针)混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的rna目的片段与特异探针(包括ces系列探针与les系列探针)互补配对结合。ces系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端同nc膜上的包被探针结合；les系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当样本为阳性、目的片段存在时可以形成“ces探针-rna目的片段-les探针-金探针复合物”。

b，层析检测

将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着nc膜向吸水纸方向层析，当有待测rna扩增产物时，“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被nc膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性；反之，若无待测rna扩增产物，复合物无法形成，胶体金颗粒无法在t线处聚集，从而不形成可见条带，此为阴性(如图4)。

无论有无待测rna产物扩增，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着nc膜向前流动，当到达c线时，与c线处包被的序列结合，从而滞留在c线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。

第二方面，提供上述解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒在制备解脲脲原体检测试剂中的应用。

本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：

1、本发明通过rna恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增uu和内参基因两种指标，扩增产物为rna，rna在自然环境中容易降解、相比较于pcr的方法扩增出dna更容易起到防止污染的效果。rna恒温扩增是在42℃环境中进行，实验仪器可简单至恒温水浴锅，最大限度地降低了实验仪器的要求。

2、由于uu的14个血清型的mba基因变异较大，本发明在设计引物时必须保证能够扩增出14个血清型株的uu核酸，因此在uu的r引物中设计了一个简并碱基，可以对uu的14种血清型全覆盖。同时本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表3及图5可知本发明试剂盒对解脲脲原体不同株总共14个血清型具有很好的检出能力。

3、本发明在设计时引入的特异探针ces系列和特异探针les系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和rna核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标rna核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在nc膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表2所列的10种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对uu(atcc编号27815)的最低检测限为1.0×10²ccu/ml。对于326份临床生殖道拭子样本的解脲脲原体检测灵敏度、特异性高于某商品化检测解脲脲原体荧光定量pcr试剂盒。

4、本发明采用rna恒温扩增技术和试纸条层析技术，既有rna恒温扩增对仪器要求低的优点，又成功融合了胶体金快速检测的优点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，也无需特殊的仪器设备，易于解脲脲原体核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

附图说明

图1rna恒温扩增原理图；

图2试纸条显色原理图；

图3试纸条示意图；

图4检测阴阳性示意图；

a：uu阴性、内参阴性，

b：uu阴性、内参阳性，

c：uu阳性、内参阳性；

图5uu14个血清型检测结果；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(newyork:coldspringharborlaboratorypress,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】核酸检测试纸条的制备

在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(nc膜)、样本垫、吸水纸、pvc底板等。

1、喷膜：

检测线uu-t：能够捕获结合uu特异探针ces序列，10μmuu-t包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；

检测线内参-t：能够捕获结合内参特异探针ces序列，10μm内参包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；

质控线(c线)：能够捕获结合c线显色探针序列，10μmc线包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；

喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。

2、试纸条组装

分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的nc膜、样品垫从上到下依次固定于pvc底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。

【实施例2】灵敏度测试

将atcc来源的uu(atcc编号27815)病原体原液进行梯度稀释后用上述方法检测，以确定最低检测限；每个梯度的稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，检出结果如下：

表1.1不同滴度uu的检测实验数据

表1.2uu最低检测限实验数据

【实施例3】特异性验证

将不同的其它病原体用上述方法检测，验证试剂盒引物及探针设计的特异性。结果如下：

表2特异性验证实验数据

从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

【实施例4】病原体检出能力验证

使用本发明试剂盒对解脲脲原体不同株总共14个血清型分别进行检测，验证本试剂盒对uu不同血清型株的检测能力。

病原体来自人脲原体核酸检测试剂国家参考品(批号360009-201301)，购自中国食品药品检定研究院。检测结果见图5，归纳列表如下：

表3不同病毒株检测结果

从以上结果可以看出，本试剂盒对uu的14个血清型均具有良好的检出能力。

【实施例4】临床样本的验证

取自武汉市第一医院皮肤科的生殖道拭子样本共326份。同时使用本发明试剂盒和某商品化检测uu的荧光定量pcr试剂盒，对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表如下：

对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行复测，结果只有一例阳性，为本发明试剂盒检测阳性某商品化荧光定量pcr试剂盒检测阴性的样本。某商品化检测uu荧光定量pcr试剂盒漏检一例，假阳2例。显而易见，本发明专利试剂盒检测生殖道拭子临床样本，对于uu检测的灵敏度更高、特异性更强。

序列表

<110>武汉中帜生物科技股份有限公司

<120>解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

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