检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学检测
技术领域：
，特别是涉及一种检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒。
背景技术：
：血吸虫病是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的全球性贫穷所致传染病。寄生于人体的血吸虫主要有日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、间插血吸虫以及湄公河血吸虫，其中，埃及血吸虫主要分布在非洲亚非拉地区、埃及尼罗河流域、苏丹、马格里布地区和阿拉伯半岛。埃及血吸虫属于扁形动物门。埃及血吸虫的生活史包括两个阶段，即在终宿主(人或其他哺乳动物)体内完成的有性生殖世代和在中间宿主螺体内完成的无性世代，经过成虫、虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴及童虫6个阶段。埃及血吸虫生活史始于虫卵从感染的人或其他哺乳动物体内排至淡水中，虫卵孵化出毛蚴，毛蚴在水中自由游动，遇到合适的中间宿主小泡螺时，即利用纤毛摆动、虫体伸缩及头腺分泌物和溶组织作用而钻入螺体内。毛蚴侵入小泡螺后，体表纤毛脱落，胚细胞分裂形成充满胚细胞的母胞蚴，母胞蚴体内的胚细胞经过分裂、增殖进而形成子胞蚴，子胞蚴具有运动性，发育成熟后自母胞蚴内逸出，并移行至螺体各组织，后继续发育为尾蚴。尾蚴分批从小泡螺体内逸出，尾蚴自螺体内逸出后，常在水体表层自由游动，当人或其他哺乳动物与含有尾蚴的水(疫水)接触时，尾蚴利用其腹吸盘前后两组穿刺腺的分泌物及尾部的摆动和体部的伸缩，迅速钻入宿主皮肤并脱去尾部转为童虫。童虫侵入小静脉或淋巴管，血流或淋巴液到右心、肺血管，最后到达肝脏，在肝内门静脉中发育成长，约经20天发育为性成熟成虫。成虫雌雄合抱逆血流移行至肠系膜下静脉、痔上静脉，有时停留在直肠静脉内，多数成虫通过痔静脉与会阴部静脉至膀胱静脉与盆腔静脉丛产卵，少数也可在直肠与肠系膜下静脉内产卵。所产虫卵主要沉积在膀胱壁、输尿管、睾丸鞘膜、附睾、阴囊、精索等泌尿和生殖器官内，还有少量会沉积于肝脏及结肠等组织，虫卵成熟后，膀胱黏膜内的虫卵落入膀胱腔内随宿主尿液排出体外，不能排出的虫卵沉积在局部组织中逐渐死亡。与日本和曼氏血吸虫相比，埃及血吸虫生长和发育较慢。有研究表明，埃及血吸虫尾蚴经皮肤感染仓鼠后，童虫在皮肤内停留3天～4天，3天～5天后移行至肺部；童虫在感染5天～8天后开始摄食，9天～10天移行至肝脏，18天～22天在肠管汇合，24天～25天器官发生，29天～30天移行至静脉丛，28天～31天雌雄合抱交配，并开始产生配生，45天～57天卵壳形成，60天开始排卵。由于经济全球化的影响，国际社会的交流逐渐增多，尤其是中非合作日益增强，近年来非洲输入新血吸虫病病例逐渐增强。相关数据显示，近来年中国赴非洲务工人员超过100万，而非洲大部分国家有埃及血吸虫病或曼氏血吸虫病流行。因此，选择有效的检测方法对境外输入性血吸虫病进行筛查、监测以及预防与控制尤为关键。目前，随着分子生物学和免疫学检测技术的发展，尤其是elisa(酶联免疫吸附测定，enzymelinkedimmunosorbentassay)方法以及pcr(聚合酶链式反应，polymerasechainreaction)方法的不断改进，以及近年来发展起来的lamp(环介导等温核酸扩增技术，loop-mediatedisothermalamplification)、qpcr(实时荧光定量pcr，quantitativereal-timepcr)等检测技术为埃及血吸虫病诊断新技术的建立提供了机遇，也促使该病的早期诊断与发现有了重大突破。但是现有的埃及血吸虫病诊断技术中，病原的分离培养十分繁琐和困难，elisa等血清学诊断存在较多的假阳性现象；lamp获得的产物无法直接克隆和测序，结果假阳性高；基于qpcr技术需要专门用于热循环反应的温度控制设备，检测时间较长，对检验人员技术要求高，检测成本较高，对于非洲等经济欠发达国家和地区现场的应用比较困难。因此，亟需一种快速简便、特异性强、灵敏度高、性价比好的埃及血吸虫检测技术。技术实现要素：基于此，有必要针对传统的埃及血吸虫检测方法或病原分离培养繁琐困难，或假阳性高、或成本较高的技术问题，提供一种检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒。本发明提供的一种检测埃及血吸虫的引物组，所述引物组包括上游引物以及下游引物；所述上游引物的序列如seqidno.1所示；所述下游引物的序列如seqidno.2所示。本发明还提供了一种检测埃及血吸虫的探针，所述探针为如seqidno.3所示序列经修饰获得。在其中一个实施例中，所述探针为在seqidno.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团以及第33位碱基修饰四氢呋喃残基。在其中一个实施例中，所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3以及cy5中的任意一种。在其中一个实施例中，所述猝灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、tamra、eclipse以及dabcyl中的任意一种。本发明还提供了一种检测埃及血吸虫的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组以及如上所述的探针组成的引物探针组合物。在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品以及临界阳性质控品。在其中一个实施例中，所述反应缓冲溶液包括450～550mm的tris-hcl、200～300mm的mgac以及质量体积百分含量为5％～15％的peg10000。在其中一个实施例中，所述阳性对照品为含有埃及血吸虫dna片段的质粒，所述临界阳性对照品为含有埃及血吸虫dna片段的质粒，所述埃及血吸虫dna片段的序列如seqidno.4所示。在其中一个实施例中，所述引物探针组合物中，所述上游引物的浓度为0.03～0.07mm；所述下游引物的浓度为0.03～0.07mm；所述探针的浓度为0.01～0.03mm；所述阳性质控品的浓度为1.0×104～8copies/μl；所述临界阳性质控品的浓度为1.0×101～4copies/μl。上述检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒，操作简便，经试验验证，该检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒用于检测埃及血吸虫时，特异性强，灵敏度和准确度高，重复性好，能够在20分钟内获得定性以及定量结果，对检测条件以及检测人员技术要求不高，检测成本较低。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1的敏感性评价试验的检测扩增图；图2为本发明实施例1的埃及血吸虫样本检测试验的检测扩增图；图3为本发明实施例1的特异性评价试验的检测检测扩增图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的瓦斯检测装置的控制方法及控制系统进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。raa(重组酶介导等温核酸扩增技术，recombinaseaidedamplification)技术，是利用重组酶与引物形成酶和引物的聚合体，在模板dna搜索与引物互补的序列区域，在单链dna结合蛋白的作用下使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下形成新的dna互补链，因此扩增形成均一的特定长度的基因片段。aa荧光法是raa技术结合荧光探针的即时检测技术，本发明基于raa荧光法，设计了检测埃及血吸虫的引物组及探针，并提供了一种检测埃及血吸虫的试剂盒，经试验验证，不仅特异性强，灵敏度和准确度高，重复性好，能够在20分钟内获得定性以及定量结果，对检测条件以及检测人员技术要求不高，检测成本较低。本发明的第一大方面，提供了一种检测埃及血吸虫的引物组，该引物组包括上游引物以及下游引物；上游引物的序列如seqidno.1所示，具体表示为5’-ctatgattatagggattcctacaggtataaag-3’。下游引物的序列如seqidno.2所示，具体表示为5’-taatatatctaatgaagaagctgataaagc-3’。本发明的第二大方面，提供了一种检测埃及血吸虫的探针，该探针为如seqidno.3所示序列经修饰获得。作为一种可选实施方式，本发明的探针为在seqidno.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团以及第33位碱基修饰四氢呋喃残基。其中，seqidno.3所示序列具体表示为：5’-ctgtgggtctcgtgtatgagatcctatagtttgatgattggttggtttta-3’。探针的荧光报告基团修饰在离5’端碱基数31bp位置上，探针的淬灭基团修饰在离3’端碱基数16bp位置上；荧光报告基团与淬灭基团之间第3个碱基位置，由四氢呋喃残基修饰。可选地，荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3以及cy5中的任意一种。可选地，猝灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、tamra、eclipse、以及dabcyl中的任意一种。本发明的第三大方面提供了一种检测埃及血吸虫的试剂盒，该检测埃及血吸虫的试剂盒包括如上所述的引物组以及如上任一项所述的探针组成的引物探针组合物。作为一种可选实施方式，该试剂盒还包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。可选地，阴性质控品为双蒸水。可选地，反应缓冲溶液包括450～550mm的tris-hcl、200～300mm的mgac以及质量体积百分含量为5％～15％的peg10000。可选地，阳性对照品为含有埃及血吸虫dna片段的质粒，临界阳性对照品为含有埃及血吸虫dna片段的质粒，埃及血吸虫dna片段的序列如seqidno.4所示。在本发明中，通过ncbi(美国国家生物技术信息中心，nationalcenterforbiotechnologyinformation)获得埃及血吸虫cox1基因序列(genebank：kt354661)信息，该基因序列如seqidno.4所示，seqidno.4所示序列具体表示为：tgctatattttttagttcagtgactatgattatagggattcctacaggtataaaggttttttcttgattatatatgcttaaaagctgtgggtctcgtgtatgagatcctatagtttgatgattggttggttttatatttttatttacgataggtggtgttactggtatagctttatcagcttcttcattagatatattatttcatgatacttgatttg。在本发明的具体实施例中，含有如seqidno.4所示序列的埃及血吸虫dna片段的质粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成质粒，质粒大小218bp。可选地，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.03～0.07mm；下游引物的浓度为0.03～0.07mm；探针的浓度为0.01～0.03mm；阳性质控品的浓度为1.0×104～8copies/μl；临界阳性质控品的浓度为1.0×102～5copies/μl。本发明提供的试剂盒中，包括40～80μl的引物探针组合物；更优选的包括50～70μl的引物探针组合物；更优选的包括60μl的引物探针组合物。其中，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.03～0.07mm；下游引物的浓度为0.03～0.07mm；更优选的，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.04～0.06mm；下游引物的浓度为0.04～0.06mm。更优选的，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.05mm；下游引物的浓度为0.05mm。探针的浓度为0.01～0.03mm；更优选的，探针的浓度为0.02mm。在本发明中，引物组和探针的溶剂优选为双蒸水。本发明提供的试剂盒中，包括25～35μl的阴性质控品；优选的包括28～32μl的阴性质控品；更优选的，包括30μl阴性质控品。在本发明中，阴性质控品优选为双蒸水。本发明提供的试剂盒中，优选的包括浓度为1.0×104～8copies/μl的阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×104～6copies/μl的阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×105copies/μl的阳性质控品。本发明提供的试剂盒中，优选包括浓度为1.0×101～4copies/μl的临界阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×101～3copies/μl的临界阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×102copies/μl的临界阳性质控品。本发明提供的试剂盒优选包括raa基础荧光通用反应试剂，raa基础荧光通用反应试剂的管数优选为24管，raa基础荧光通用反应试剂管的规格优选为150～250μl，更优选为200μl；raa基础荧光通用反应试剂优选以冻干粉的形态提供。本发明对所述raa基础荧光通用反应试剂的来源没有特殊限定，本发明实施例中使用的raa基础荧光通用反应试剂采购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为f00001。本发明提供的试剂盒中，优选包括1000～1800μl的反应缓冲液，更优选的包括1200～1600μl的反应缓冲液，更优选的包括1400μl的反应缓冲液。反应缓冲液的ph值优选为7.0～8.4，更优选为7.4～8.0，更优选为7.6。本发明提供的试剂盒中，优选的反应缓冲液包括：450～550mm的tris-hcl、200～300mm的mgac以及质量体积百分含量为5％～15％的peg10000；更优选的反应缓冲液包括：480～520mm的tris-hcl、220～280mm的mgac以及质量体积百分含量为8％～12％的peg10000；更优选的反应缓冲液包括：500mm的tris-hcl、250mm的mgac以及质量体积百分含量为10％的peg10000。可选地，本发明的试剂盒在使用时，实时raa荧光反应体系每50μl包括：47μl反应缓冲液，2μl引物探针组合物，1μl样品(或阴性质控品，或阳性质控品，或临界阳性质控品)。进一步可选地，本发明的试剂盒在使用时，实时raa荧光反应的条件如下：实时raa荧光反应的温度优选为30～42℃，更优选为35～40℃，更优选为39℃。实时raa荧光反应的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，更优选为20min。进一步可选地，本发明的试剂盒在使用时，检测埃及血吸虫dna的结果分析条件优选设定为：在20min内荧光检测仪器检测到信号明显增强，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min内荧光仪器信号无增加，显示扩增结果为阴性。在本发明中，待测样品包括埃及血吸虫的成虫、虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴及童虫中的任意一种或几种形态的dna提取物。待测样品的制备方法优选为：用组织样本dna提取试剂盒提取埃及血吸虫的dna，操作步骤按照试剂盒说明书进行，得到待测样品。在试剂盒使用时，样品的量优选为0.5～1.5μl，样品的量更优选为1μl。下面结合具体实施例对本发明检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1试剂盒组成如表1所示，其中，本实施例中的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，经过hplc检测合格，探针的荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。经过修饰后的探针为ctgtgggtctcgtgtatgagatcctatagt/i6famdt/t/idsp/a/ibhq1dt/gattggttggtttta。表1实施例1的试剂盒组成敏感性评价试验将5μl埃及血吸虫基因重组dna质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的浓度为1010copies/μldna质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：工作标准品1，含有1.0×106copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段；工作标准品2，含有1.0×105copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段，等同于阳性质控品；工作标准品3，含有1.0×104copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段；工作标准品4，含有1.0×103copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段；工作标准品5，含有1.0×102copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段，等同于临界阳性质控品；工作标准品6，含有1.0×101copies/μl埃及血吸虫cox1基因的非传染性dna片段。反应体系配制：吸取376μl反应缓冲液，加入16μl引物探针组合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μl试剂分别加入到7个装有raa基础荧光通用反应试剂的反应管中，使冻干粉充分溶解并混均；在7个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1作为模板，反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。检测仪器：采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪。仪器设置为：反应温度39℃，反应时间为20分钟。将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。检测结果如附图1所示，结果显示最快2分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。并且能检测到工作标准品6含有1.0×101copies/μl的荧光信号，敏感性高。埃及血吸虫样本检测试验样本来源：样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，样本为埃及血吸虫的成虫。dna提取：dna提取采用qiagen商品化试剂盒提取组织样本dna，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的dna于-80℃保存备用。反应体系配制：取2个反应管，分别按如下操作，吸取47μl反应缓冲液，加入2μl引物探针组合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到装有raa基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在2个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好的dna作为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。检测仪器：采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；仪器设置：反应温度39℃，反应时间20分钟。将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟，检测结果如附图2所示。结果显示6分钟明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。特异性评价试验样本来源：样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，样本包括埃及血吸虫虫卵，曼氏血吸虫虫卵、日本血吸虫虫卵，十二指肠钩蚴培养物，细粒棘球绦虫的包囊，肝吸虫样本为感染肝吸虫的鱼样本，蛔虫虫卵。dna提取：dna提取采用qiagen商品化试剂盒提取组织样本dna，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的dna于-80℃保存备用。本实施例中，试剂盒购自qiagen公司。反应体系配制：取8个反应管，分别按如下操作，吸取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到装有raa基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在8个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、1μl埃及血吸虫虫卵样本dna、1μl曼氏血吸虫虫卵样本dna、1μl日本血吸虫虫卵样本dna、1μl十二指肠钩虫样本dna、1μl肝吸虫样本dna、1μl细粒棘球绦虫样本dna、1μl蛔虫虫卵样本dna作为模板，反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。检测仪器：采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪。仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。检测结果如图3所示，结果显示只有埃及血吸虫虫卵样本dna明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性好。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。由实施例1的以上实验结果可以得出，本发明提供的引物组、探针及相应的试剂盒能够快速检测埃及血吸虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。实施例2至8采用与实施例1相同的试剂盒、相同的方法分别进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，与实施例1不同之处在于仪器设置的反应温度与反应时间不同，具体区别如表2所示。表2实施例2至8的反应条件实施例反应温度/℃反应时间/min实施例23015实施例33518实施例43720实施例54022实施例64225实施例73025实施例84215实施例2至8的各试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。实施例9试剂盒组成如表3所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。表3实施例9的试剂盒组成采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。实施例10试剂盒组成如表4所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。表4实施例10的试剂盒组成采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。实施例11试剂盒组成如表5所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。表5实施例11的试剂盒组成采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。实施例12试剂盒组成如表6所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。表6实施例12试剂盒的组成采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。实施例13至60采用与实施例1相同的方法分别进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，与实施例1不同之处仅在于试剂盒中探针的荧光报告基团以及淬灭基团不同，具体区别如表7所示。表7实施例13至60的探针修饰基团采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、埃及血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，采用本发明公开的荧光报告基团以及淬灭基团修饰的探针，应用在检测埃及血吸虫的试验中，检测的敏感性以及特异性高，重复性好。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>江苏省血吸虫病防治研究所江苏奇天基因生物科技有限公司<120>检测埃及血吸虫的引物组、探针及试剂盒<130>wxi20190121<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>artificialsequence<400>1ctatgattatagggattcctacaggtataaag32<210>2<211>30<212>dna<213>artificialsequence<400>2taatatatctaatgaagaagctgataaagc30<210>3<211>50<212>dna<213>artificialsequence<400>3ctgtgggtctcgtgtatgagatcctatagtttgatgattggttggtttta50<210>4<211>218<212>dna<213>artificialsequence<400>4tgctatattttttagttcagtgactatgattatagggattcctacaggtataaaggtttt60ttcttgattatatatgcttaaaagctgtgggtctcgtgtatgagatcctatagtttgatg120attggttggttttatatttttatttacgataggtggtgttactggtatagctttatcagc180ttcttcattagatatattatttcatgatacttgatttg218当前第1页1 2 3