一种检测高油酸花生的方法及其应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种检测高油酸花生品种的方法及其应用。
背景技术：
：高油酸花生，顾名思义指种子中油酸含量高的花生，通常油酸含量达75％以上。因为其相关产品货架期长等优点，是目前花生育种的一大热点。普通花生，其种子富含油酸和亚油酸，脂肪酸去饱和酶2(fattyaciddesaturase2，即fad2)可以将油酸转化成亚油酸。由于栽培种花生为异源四倍体，在a和b基因组各存在一个fad2基因，分别为fad2a和fad2b。两个基因序列中碱基突变后，酶活性丧失，脂肪酸去饱和酶功能丧失，油酸无法转化成亚油酸，亚油酸合成受到抑制，油酸含量提高，从而变成高油酸花生。高油酸花生是普通油酸花生fad2基因(包括fad2a和fad2b)的突变体。技术实现要素：为了筛选鉴定高油酸花生种质、品种或品系，本发明研究出一种检测高油酸花生的方法及其应用。本发明提供了一种检测高油酸花生的方法，它主要包括以下步骤：(1)根据fad2a和fad2b基因序列的差异，设计花生fad2a或fad2b基因特异性引物；(2)分别提取普通花生和可能的高油酸花生的dna，利用步骤(2)中的引物进行pcr扩增；(3)利用celi酶进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。进一步的，所述步骤(1)中花生fad2b基因特异性引物的序列为：上游引物fad2b-f：ctcatatgttgtctatgatctcttaa下游引物fad2b-r：gcgtatcagttatatgatgaaatgcc。进一步的，所述步骤(2)中pcr反应的条件为90～98℃预变性5分钟；90～98℃变性30秒，50～60℃退火30秒，68～72℃30秒，40个循环；68～72℃后延伸10分钟；退火预变性90～99℃10分钟，70～90℃20秒，95个退火循环。进一步的，所述退火循环为从80℃开始，每个循环下降0.3℃，每个温度7秒。进一步的，所述步骤(3)中酶切的具体方法为：将celi酶和pcr产物、双蒸水放入切割缓冲液中，在40～50℃下，酶切25～30分钟，加入反应终止液edta。进一步的，所述步骤(3)中根据琼脂糖凝胶电泳的判断方法为：设计的引物扩增片段大小为c，而产生变异的位点将c分成了a和b，从而经琼脂糖凝胶电泳，如果待检测花生为高油酸花生，可产生大小为a、b和c的条带，如果不是高油酸花生，则只产生c大小的条带。本发明所述的检测方法，还可以应用于检测大豆、油菜等高油酸种质、品系或品种。与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：目前应用最多的鉴定高油酸花生的方法是借助近红外模型对花生种子进行扫描来完成，高油酸花生是fad2a和fad2b基因变异导致，研究者在借助高油酸花生和普通花生搭配杂交组合时，会产生数以万计的后代，利用该方法可以规模化筛选杂交后代的fad2基因型，而无需等待花生种子收获借助近红外等手段进行筛选鉴定。此外，该方法比将待检测样品fad2a和fad2b基因pcr扩增，然后测序的方法，节约了成本。附图说明图1celi酶切pcr产物后的电泳图。图2分别来自花育9303(fad2)和15p9-1(fad2)的fad2b基因测序结果比对。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。实施例1本发明根据celi酶能高效特异的识别双链dna中碱基突变形成的错配和扭曲，并准确切割异源双链dna中存在的错配位点的特性，将待检测的花生样品(可能的高油酸后代)与普通花生(我们标记为fad2)的dna混合做为模板，进行pcr扩增，因高油酸花生(普通花生fad2基因突变体，我们标记为fad2)和普通花生脂肪酸去饱和酶(fad2)fad2基因序列的差异，在pcr复制过程中来源于高油酸花生(fad2)和普通花生(fad2)fad2基因片段形成杂合体(即异源双链dna，fad2/fad2)，celi酶切pcr产物，借助琼脂糖凝胶电泳，可以检测到大小不同的条带，从而可以检测出fad2基因变异的植株(即高油酸花生，fad2)，如果待检测的花生为普通花生(fad2)：pcr扩增产生的fad2/fad2，将不能被celi酶切出特异片段。利用我们的方法，假如有1000个花生样品需要检测是否高油酸花生，我们可以10个一组dna混合组做为一个样品，这样就只有减少为100个样品，通过检测这100个样品，可以将高油酸花生限定在10个待检测个体的范围内，然后在对这10个样品进行检测，节约了时间，减少了成本，提高了效率。本实施例具体包括以下试验过程：(1)将普通花生和可能的高油酸花生后代品系进行分子标记；植物材料为普通花生“花育9303”和本课题组创制的可能的高油酸花生后代品系“15p9-1”。dna分子量标记、pcrmix等购自北京全式金生物有限公司。我们在做花生杂交育种时，用的亲本之一的高油酸花生为fad2a和fad2b同时变异的花生材料，因此，我们可通过筛选fad2b基因是否变异，来验证待检测样品是否高油酸花生。首先设计花生fad2b基因特异性引物，其中：fad2b-f上游引物：ctcatatgttgtctatgatctcttaa和fad2b-r下游引物:gcgtatcagttatatgatgaaatgcc。(2)分别提取普通花生和可能的高油酸花生后代品系的dna，利用步骤(1)中的引物进行pcr扩增，分别提取“花育9303”和“15p9-1”幼嫩叶片dna，以fad2b-f和fad2b-r为引物进行pcr扩增，pcr反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃30秒，40个循环；72℃后延伸10分钟；退火预变性99℃10分钟，80℃20秒，95个退火循环(80℃7秒，每个循环温度递减0.3℃，即从80℃开始，每个循环下降0.3℃，每个温度7秒)。(3)利用celi酶进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，pcr产物用celi酶切，celi酶为本实验室制备保存，酶切体系20μl，包括：切割缓冲液(20mmhepesph7.5,10mmkcl和3mmmgcl2)2μl，celi酶1微升，pcr产物14微升，双蒸水3微升。45摄氏度条件下，酶切30分钟，然后加入反应终止液(75mmedtaph8.0)5微升，电泳图如图1所示，其中图中附图标记分别为，fad2：pcr模板为花育9303(普通油酸含量)，fad2：15p9-1(待检测花生)，fad2/fad2：为15p9-1和花育9303dna混合物。从图1可以看出，普通花生(fad2)和待检测花生(fad2)因为都是纯合体，pcr扩增后，经酶切未检测到酶切产生的条带。琼脂糖凝胶电泳的判断方法为：设计的引物扩增片段大小为c，而产生变异的位点将c分成了a和b，从而经琼脂糖凝胶电泳，如果待检测花生为高油酸花生，可产生大小为a、b和c的条带，如果不是高油酸花生，则只产生c大小的条带，而我们检测的花生样品与普通花生混合dnafad2/fad2经pcr扩增产生杂合体(c)，经celi酶切，产生了300bp和400bp两条多余条带(a和b)。我们初步认为我们检测的高油酸花生后代品系“15p9-1”为fad2b基因的突变体，即高油酸花生，其中m是分子量标记。对dna进行测序，我们分别对来自普通油酸花生“花育9303”和待检测花生“15p9-1”扩增fad2b基因的pcr产物进行了测序。结果发现(图2)来自“15p9-1”的fad2b基因第489个碱基“g”突变成了“a”，形成了一个终止密码子“tga”，造成了fad2b基因翻译提前终止，无法行使脂肪酸去饱和酶功能，因证明“15p9-1”是高油酸花生。我们分别对花育9303和“15p9-1”种子中油酸和亚油酸的含量进行了近红外检测，发现普通花生花育9303油酸含量仅44.7％，而“15p9-1”油酸含量达到76.6％，是高油酸花生。证明我们的方法是可靠的，如表1，除此之外，该筛选鉴定方法除在花生中应用外，还可以用于检测大豆、油菜等高油酸、品系或品种。花生材料油酸含量(％)亚油酸含量(％)花育930344.734.615p9-176.66.1以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。当前第1页1 2 3