‘寒富’杂种后代自花结实性的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种位于苹果4号染色体上与‘寒富’苹果自花结实性状相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

苹果是全世界最重要的果树之一，传统培育新品种的方法主要是杂交育种，而常规杂交育种方法周期长、速度慢、效率低。由于苹果遗传背景非常复杂，生命周期长，杂种实生苗童期长，杂交后代性状广泛分离和变异，杂合度非常高等特点，给特定优良性状育种带来很大的困难。因此，分子标记辅助育种可以在育种早期进行筛选，并且具有高效、快速、稳定、可靠等优点。

自然界中，大多数苹果品种都是自花不结实性的，需要配置授粉树或者人工授粉才能正常结实，这给生产者带来了很多工作量以及大量的成本，因此培育自花结实性品种是苹果育种工作者一项重要的目标。已知的研究中，控制苹果自花结实性的基因主要位于17号染色体上，而位于其它染色体上的因子了解非常少。传统的qtl定位虽然可以定位出与自花结实性性状相关的位点，但由于群体大小，环境因素等影响使得qtl定位陷入困境。随着测序技术的普遍和苹果高密度snp的开发，使得全基因组关联分析(gwas)能够对很多重要性状的候选基因座进行鉴定。因此，通过gwas分析，可以得到与自花结实性相关的snp标记，从而提前选育自花结实性的品种，为育种工作者提供帮助，减少育种年限。

技术实现要素：

为了弥补现有自花结实性分子标记的不足，本发明旨在提供一种位于4号染色体上与‘寒富’群体自花结实性相关的分子标记。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的引物对。

本发明的再一目的在于提供一种筛选自花结实性苹果品种的方法。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种‘寒富’杂种后代自花结实性的snp分子标记，所述snp分子标记对应于金冠苹果基因组malusxdomesticagenome(gddh13v1.1)参考序列4号染色体正链方向的第25831655号碱基上存在一个a/g转换类型的单核苷酸多态性变异：

所述的位于苹果4号染色体上与自花结实性相关的snp分子标记核苷酸序列如seqidno:1所示，其中序列中m是ag杂合或者是gg纯合，导致‘寒富’苹果自花结实性的差别：

所述的位于苹果4号染色体上与自花结实性相关的snp分子标记的snp的位点为seqidno:1序列标注位置为121位碱基处存在一个a/g转换类型的单核苷酸多态性变异；

所述的位于苹果4号染色体上与自花结实性相关的snp分子标记在筛选自花结实性苹果中的应用；

本发明还提供了用于鉴定‘寒富’杂种后代自花结实性的snp分子标记的引物，所述引物包括正向引物f和反向引物r；

所述正向引物f：5’ggataaaatgacaaaaataccctc3’，如seqidno:2所示；

所述反向引物r:5’agattattggtaatatatcattttaggctt3’，如seqidno:3所示；

本发明还提供含有上述引物用于检测自花结实性苹果的试剂盒。

本发明还提供利用上述snp分子标记筛选自花结实性苹果品种的方法，包含如下步骤：

步骤(1)：提取苹果叶片的dna；

步骤(2)：以dna为模板，使用用于鉴定‘寒富’杂种后代自花结实性的snp分子标记的引物进行pcr扩增；

步骤(3)：检测苹果4号染色体上与‘寒富’自花结实性相关的snp分子标记；

步骤(4)：根据snp分子标记的基因型判断苹果的自花结实性高低；

在上述方案的基础上，所述的snp分子标记的5’端第121位单核苷酸是a/g杂合，则自花结实性低，所述的snp分子标记的5’端第121位单核苷酸是g/g纯合，则自花结实性高。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究找到与自花结实性相关的分子标记位于苹果4号染色体核苷酸序列上，可以通过筛选其优势等位基因，提前选出可能自花结实性的苹果品种，在培育自花结实性新品种中有十分重要的意义。

本发明提供一种鉴定上述位于苹果4号染色体上与‘寒富’自花结实性相关的snp分子标记的引物对，包含正向引物f和反向引物r,其核苷酸序列如下所示：

正向引物f：5’ggataaaatgacaaaaataccctc3’

反向引物r:5’agattattggtaatatatcattttaggctt3’

通过上述引物，可以提前预测苹果自花结实性，加快自花结实性苹果的进程。

附图说明

本发明有如下附图：

图1是‘寒富’ב岳帅’在4号染色体上关于苹果自花结实性性状的全基因组关联分析(gwas)曼哈顿图；

其中：横坐标表示snp分子标记在苹果4号上的位置：纵坐标表示-logp值。

图2是不同基因型苹果的自花结实率差异分析图。

具体实施方式

以下结合附图1～2对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)实验植物

本发明所使用的实验苹果群体为‘寒富’ב岳帅’杂交群体栽种于辽宁农业科学院果树研究所，共304株。

本实验所选取该资源群体统一进行植株管理。

(2)样本采集

通过自花授粉试验选取自花结实性的43株与自花不结实性的52株，于春季采取其叶片保存到液氮罐中，再带回存放于-80℃冰箱中保存备用。

(3)群体基因组重测序

使用tiangen提取dna试剂盒提取dna，基于illuminahiseqxten测序平台进行双端测序，得到大量高质量的snp。

(4)全基因组关联(gwas)分析

利用tassel5.2.36软件的glm模型程序，对群体材料的自花结实性状进行全基因组snp关联分析。

gwas分析结果如图1所示，在这个群体中，4号染色体中存在显著影响‘寒富’苹果自花结实性的位点，最强关联的snpa位点为g.121。该位点在自花结实性品种43株中有35株为g/g,自花不结实性品种52株中有40株为a/g。

实施例2目的dna扩增及测序

(1)引物的设计

通过gdr网站(https://www.rosaceae.org)下载4号染色体上seqidno:1的dna序列。

并利用设计引物软件primerpremier5.0设计引物。

设计引物的dna序列如下所示：

正向引物f：5’ggataaaatgacaaaaataccctc3’

反向引物r:5’agattattggtaatatatcattttaggctt3’

(2)pcr扩增

10ul反应体系中加入dna模板1ul，双蒸水3ul，2xtaqpcrmix5ul，正向引物f和反向引物r各0.5ul。

pcr反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，34个循环，最后72℃延伸10min。

(3)dna序列测定

将pcr产物送给生工生物工程(上海)股份有限公司进行正向反向测序，得到下列碱基序列。

ggataaaatgacaaaaataccctcaatttttgtcaaatcattttggctcattgtttattaaattgaaagtatttttgtcatttgattcttaattaacataattattcaagm[a/g或g/g]aatgatcaaaatgattaatggtagataaactcaggaccactcatgttgatttcaaatctcaggaccaaagtgatgagttatgcaaatctcaaggaacattttaactaaaaagcctaaaatgatatattaccaataatct

(4)在‘寒富’ב望香红’群体中应用

将以上标记引物用于‘寒富’ב望香红’群体中，通过测序发现带有gg位点的品种，75％为自花结实性品种，可见该方法可以提高育种效率，效率比常规育种高1-2倍，可用于早期鉴定，节省育种时间，种植空间以及劳动力等。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110>中国农业大学

<120>寒富’杂种后代自花结实性的snp分子标记及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>250

<212>dna

<213>苹果(malusdomestica)

<220>

<221>misc_feature

<222>(121)..(121)

<223>m=a或g

<400>1

ggataaaatgacaaaaataccctcaatttttgtcaaatcattttggctcattgtttatta60

aattgaaagtatttttgtcatttgattcttaattaacataattattcaagaaatgatcaa120

matgattaatggtagataaactcaggaccactcatgttgatttcaaatctcaggaccaaa180

gtgatgagttatgcaaatctcaaggaacattttaactaaaaagcctaaaatgatatatta240

ccaataatct250

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>2

ggataaaatgacaaaaataccctc24

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>3

agattattggtaatatatcattttaggctt30