水稻耐高温性状的连锁KASP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种水稻耐高温性状的连锁kasp分子标记及其应用。

背景技术：

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。高温是水稻生产中的主要胁迫，严重时可以造成水稻产量50％～80％的减产。选育与种植耐高温品种是保障水稻粮食生产安全的有效方法。尽管水稻耐高温性的研究取得了长足的进展，但耐高温性状主要是数量性状，水稻苗期和抽穗期耐高温性状的遗传基础仍不清楚。传统的依靠高温筛选鉴定抗性品种和育种材料的选育方法因为环境和人为因素的影响对表型评价误差较大，需要多年多批次的重复鉴定，需要更大的杂交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。而利用耐高温性状qtl定位的连锁标记，从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标耐高温基因的单株进行杂交(回交)，育种家不但能准确的进行目标性状方向的育种，而且能减小杂交(回交)群体的大小，节省成本。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的dna序列多态性。它是生物可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。相对于传统的ssr标记、indel标记，snp标记具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量分型的特点，在分子育种领域有着广泛的应用。现阶段，适用于snp检测的方法主要有凝胶电泳、荧光定量pcr、基因芯片和竞争性等位基因pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)。dna芯片技术是检测snp的最常用方法，但该方法的成本较高。kasp(kompetitiveallelespecificpcr，即竞争性等位基因特异性pcr)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对snp进行分型，该技术具有高度的稳定性与准确性。kasp的基因分型方法是通过计算pcr过程中产生的荧光信号，实现对变异位点的检测，检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害。相比于dna芯片技术，利用kasp技术进行snp检测的成本较低，其成本与检测的snp位点数呈正相关。因此，基于kasp技术开发snp标记进行品种鉴定，可大大提高鉴定效率，是具有重要意义的。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一组水稻耐高温性状的连锁kasp分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述连锁kasp分子标记的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一组水稻耐高温性状的连锁kasp分子标记，连锁kasp分子标记为7238、6400、7334；分子标记7238为qtl区间qssr7-1的连锁标记，分子标记6400、7334为qtl区间qssr11-1的连锁标记；

分子标记7238为第7染色体29287238位碱基上的变异c/t，分子标记6400为第11染色体26796400位碱基上的变异a/c，分子标记7334为第11染色体26797334位碱基上的变异a/g。

用于扩增上述连锁kasp分子标记7238、6400、7334的引物，分子标记6400的连锁kasp分子标记的引物序列如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示；

分子标记7334的连锁kasp分子标记的引物序列如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示；

分子标记7238的连锁kasp分子标记的引物序列如seqidno.7、seqidno.8和seqidno.9所示。

本发明提供一种用于改良水稻耐高温性的试剂盒，包含上述连锁kasp分子标记7238、6400、7334的引物。

本发明提供一种上述连锁kasp分子标记、上述连锁kasp分子标记引物或上述试剂盒在筛选耐高温水稻品种中的应用。

本发明提供一种上述连锁kasp分子标记、上述连锁kasp分子标记引物或上述试剂盒在水稻耐高温性改良育种中的应用。

本发明还提供一种利用上述kasp分子标记的引物进行基因分型的方法，包括如下步骤：

以植物基因组dna为模板，采用上述kasp分子标记7238、6400和/或7334的引物进行pcr(聚合酶链式反应)，待反应完成后，将pcr扩增的产物借助荧光信号采集仪器，获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型；

反应的体系包括20～30ng/l、dna2μl，上述kasp分子标记7238、6400或7334的引物各0.28μl和2×kaspmastermixture；

反应的条件为：94℃15min；94℃20sec，63℃～55℃1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃20sec，56℃1min，共26个循环；

荧光信号值的读取条件为16℃，20sec；

荧光信号采集仪器包括但不限于荧光定量pcr仪。

本发明还提供了一种基于上述kasp分子标记鉴定水稻品种耐高温qtlqssr7-1、qssr11-1基因型的方法，包括以下步骤：

(1)提取待鉴定水稻品种的dna样本；

(2)以利用上述分子标记7238、6400和/或7334进行kasp检测；

(3)根据荧光信号结果，判断待检测水稻品种的qssr7-1、qssr11-1基因型：若只检测到6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，以下缩写为fam)荧光信号，则待测水稻品种为耐高温基因型；若只检测到六氯－6－甲基荧光素(hexachlorofluorescein，以下缩写为hex)荧光信号，则待测水稻品种为高温敏感基因型；若同时检测到两种荧光信号，则待测水稻品种为杂合基因型。

本发明还提供一种基于上述分子标记改良水稻品种耐高温性的方法，包括以下步骤：

1)以对高温敏感的待改良品种为受体亲本，以耐高温的品种为供体亲本；

2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种f1；

3)将受体亲本作为目标，与步骤2)获得的杂交种f1单株做杂交，获得回交种子bc1f1；

4)在步骤3)获得的bc1f1植株苗期，提取dna样品，利用上述kasp分子标记7238、6400和/或7334进行分子标记辅助选择，筛选含有耐高温等位基因型的植株，将其作为父本继续与受体亲本进行杂交，获得bc2f1种子；

5)在步骤4)获得的bc2f1植株苗期，提取dna样品，重复步骤4)获得bc3f1种子；

6)将步骤5)获得的bc3f1杂交单株种植成行，自交，收获杂交种bc3f2；

7)将步骤6)获得的bc3f2种植成500株的分离群体，在苗期提取dna，利用所述分子标记筛选，获得两个耐高温qtl区间纯合等位基因型的单株；

8)将步骤7)获得的单株，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。

本发明还提供另外一种基于上述kasp分子标记改良水稻品种耐高温性的方法，包括以下步骤：

(1)以对高温敏感的的待改良品种为受体亲本，以耐高温的品种为供体亲本；

(2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种f1；

(3)种植步骤(2)获得的f1种子得到f2群体，在植株苗期提取每个单株dna样品，利用上述kasp分子标记7238、6400和/或7334进行分子标记辅助选择，筛选含有两个耐高温qtl区间等位基因型的植株；

(4)将步骤(3)获得的植株种植成行，自交，筛选符合育种目标农艺性状的株系，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。

本发明的有益效果是：

(1)利用本发明的连锁kasp分子标记及其引物序列与试剂盒，可在早期(种子或苗期)检测育种材料的耐高温qtl区间的等位基因型，预测育种材料的耐高温性，对育种材料进行准确筛选，不需要将育种材料种植在高温筛选圃中鉴定。从而促进耐高温水稻品种的遗传改良，提高品种培育效率。并且与现有的分子标记相比，耐高温性状连锁kasp分子标记实验操作简单快捷，只需要进行pcr检测，检测过程无需使用的eb或者聚丙烯酰胺等对环境造成污染的试剂，对人体不产生危害，检测体系高效、环境友好，具有较好商业化应用前景。

(2)本发明采用kasp方法检测snp位点，检测方法操作简单，成本低，检测结果准确可靠，适用于高通量规模化的商业化育种应用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的分子标记7238标准dna样本分型图。

图2是本发明实施例1的分子标记6400标准dna样本分型图。

图3是本发明实施例1的分子标记7334标准dna样本分型图。

具体实施方式

以下实施例中所用的热敏感籼稻品种9311的审定编号为苏种审字第262号；耐热籼稻品种n22为来自非洲的耐高温种质资源，由菲律宾国际水稻研究所提供。这两份种质资源在国家水稻数据中心公开。利用9311与n22创制的cssl群体为发明人培育的遗传材料。上述所有水稻品种和种质资源均可从安徽农业大学获得。

实施例1

分子标记7238、6400、7334的引物开发制备方法，其步骤是：

根据发明人之前的研究，以耐高温籼稻品种n22和高温敏感籼稻品种9311为材料，建立了一套新的染色体片段代换系(cssls)，并对其进行了遗传基础分析。采用相对电导率(rec)和结实率(ssr)研究了高温胁迫对水稻苗期和抽穗期的影响。该研究明确了水稻抽穗期耐高温性与其在高温胁迫下的结实率具有显著正相关。并且该研究定位了5个耐高温qtl：qssr6-1、qssr7-1、qssr8-1、qssr9-1和qssr11-1。其中qssr7-1和qssr11-1解释了较高的表型变异，分别是26.35％和14.21％。针对qssr7-1和qssr11-1这两个qtl区间，我们从ricevarmap网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/)上检索到9311与n22之间有3个有效突变位点：vg1126796400、vg1126797334、vg0729287238，并将此3个突变位点上下游各100bp的序列下载下来，设计kasp分子标记引物，开发成qssr7-1和qssr11-1的连锁kasp标记7238、6400、7334。

连锁kasp分子标记6400的引物序列如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示，具体序列为：

6400-f1：gaaggtgaccaagttcatgcttatgttaactgatgtatatcaaa

6400-f2：gaaggtcggagtcaacggatttatgttaactgatgtatatcaac

6400-r：taggcgcagggattcgcttatgg

连锁kasp分子标记7334的引物序列如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示，具体序列为：

7334-f1：gaaggtgaccaagttcatgcttgttctcttttccctcaactcttaa

7334-f2：gaaggtcggagtcaacggatttgttctcttttccctcaactcttag

7334-r：gctctcagtgaaatgacatccaagg

连锁kasp分子标记7238的引物序列如seqidno.7、seqidno.8和seqidno.9所示，具体序列为：

7238-f1：gaaggtgaccaagttcatgctcaccatggctattggtgttcgtc

7238-f2：gaaggtcggagtcaacggattcaccatggctattggtgttcgtt

7238-r：agagaggcatgagcatcgagaacc

其中，f1引物序列中前面的小写字母部分为fam通用荧光标签序列，f2引物序列中前面的小写字母部分为hex通用荧光标签序列。上述kasp分子标记的引物序列中的fam和hex通用荧光标签序列还可以采用其他本领域通用的通用荧光标签序列。

根据网站数据，高温敏感品种9311与耐高温种质资源n22在kasp分子标记7238的核苷酸差异是c/t，在kasp分子标记6400的核苷酸差异是a/c，在kasp分子标记7334的核苷酸差异是a/g。

1)提取9311和n22的dna，作为高温敏感等位基因型和耐高温等位基因型的标准dna样本，取两个品种的等量dna混合，作为杂合基因型的标准dna样本。

2)应用发明内容提供的kasp分子标记7238、6400、7334与基因分型的方法，对4组dna样本(各3个重复)：9311、n22、杂合基因型、阴性对照(超纯水)，进行kasp检测，检测结果如图1、图2和图3所示。

3)在图1、图2和图3中，x轴为hex荧光信号坐标轴，y轴为fam荧光信号坐标轴。图中的正方形为耐高温等位基因型(n22)分布点，三角形为杂合基因型分布点，圆形为敏感等位基因型(9311)分布点，菱形为阴性对照分布点。说明该标记可以准确地区分耐高温等位基因型、敏感等位基因型和杂合基因型。

实施例2

kasp分子标记7238、6400、7334的引物应用方法，其步骤是：

(1)应用发明内容提供的kasp分子标记7238、6400、7334与基因分型方法的对9311/n22的cssls群体10个单株进行基因型鉴定，从中筛选出带有耐高温qtlqssr7-1和qtlqssr11-1基因组区段的株系cssl74、cssl105。cssl74携带有耐高温qtlqssr7-1，cssl105携带有耐高温qtlqssr11-1。

(2)将步骤(1)得到的两个单株进行杂交，得到f1种子，种植到田里得到f1代单株，每个f1代单株套袋自交获得f2代种子。

(3)将步骤(2)获得的f2代种子在实验室内发芽，提取dna，采用发明内容提供的kasp分子标记7238、6400、7334与基因分型方法的对1200株f2代苗子进行基因型鉴定，筛选出聚合了qtlqssr7-1和qtlqssr11-1的纯合单株52株。

(4)将步骤(3)所获得52株单株种植到高温筛选圃鉴定耐高温性状，鉴定结果如表1所示。

表1：高温鉴定结果表

由表1可见，本发明的连锁kasp分子标记7238、6400、7334与耐高温性明显相关，聚合了两个qtl的株系，耐高温性显著提高。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>水稻耐高温性状的连锁kasp分子标记及其应用

<130>no

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

<210>2

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

<210>5

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

<210>7

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9